應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測實驗用貓巴爾通體的感染*

馮育芳 邢 進(jìn) 王 吉 付 瑞 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

貓(Cat, Felidae)來自于哺乳綱食肉目貓科貓屬，自古作為人類的寵物存在。鑒于貓與人類的密切關(guān)系及其特殊的生理特點，貓從19世紀(jì)末開始被用于實驗研究[1-2]。但由于繁殖和飼養(yǎng)上的困難，貓的實驗化進(jìn)展較為緩慢。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，貓可以耐受麻醉及部分腦破壞手術(shù)，而且在手術(shù)時能保證正常血壓，這與人的反射功能近似；此外，貓的循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉系統(tǒng)發(fā)達(dá)，可用于相關(guān)研究。因此，貓作為實驗用動物在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛[3]，在某些實驗中，如降壓實驗、作為弱視動物模型[4]、腦出血模型[5]及高眼壓動物模型等方面具有不可替代的作用[3]。

巴爾通體(Bartonella)是一群革蘭氏染色陰性、營養(yǎng)條件要求苛刻的需氧桿菌。巴爾通體由吸血節(jié)肢動物傳播，已證實能感染多種溫血動物(犬、貓、嚙齒動物)和冷血動物(爬行類、兩棲類)脊椎動物[6]，引起巴爾通體病。流行病調(diào)查顯示，家貓是漢賽巴爾通體(Bartonellahenselae)和克氏巴爾通體(Bartonellaclarridgeiae)的主要宿主。而貓攜帶的巴爾通體可以通過白蛉、跳蚤、蜱、虱及恙螨等昆蟲媒介傳播給人，可引起人類卡瑞恩病、戰(zhàn)壕熱、貓抓病、心內(nèi)膜炎、菌血癥等疾病，是一種廣泛存在的人獸共患病原[7]。基于此，國內(nèi)外實驗動物微生物標(biāo)準(zhǔn)已要求檢測并排除該菌。

基于貓普遍攜帶巴爾通體的現(xiàn)狀和實驗動物的微生物質(zhì)量控制要求，建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的巴爾通體檢測手段是非常必要的。目前用于診斷該病的方法有細(xì)菌培養(yǎng)分離法、ELISA和PCR等，細(xì)菌培養(yǎng)分離存在費時、操作繁瑣、無法定量等缺點；血清學(xué)診斷方法存在巴爾通體亞種間的交叉問題[8]。實時熒光定量PCR方法將PCR與熒光檢測方法相結(jié)合，具有操作簡便、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點，已成為病原檢測的重要方法，可滿足當(dāng)前對貓巴爾通體的檢測需要。貓巴爾通體實時熒光定量PCR方法的建立將為貓的微生物檢測和貓的實驗動物化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

伊麗莎白巴爾通體(B.elizabethae, 49227)、漢賽巴爾通體(B.henselae, 49882)、克氏巴爾通體(B.clarridgeiae, 51734)和拉漢姆巴爾通體(B.grahamii,Birtles, 700132)購自ATCC，均為我國主要流行的巴爾通體菌株。用于特異性檢測菌株分別為：肺鏈(31210)、肺鏈(36001)、乙鏈(32310)、小鼠放線(49577)、支敗(19395)、支敗(58401)、嗜肺(12555)、嗜肺(35149)、多殺(43137)、鼠棒(65013)、李斯特(54004)、支原體(MP)和支原體(15531)均由本實驗室保存鑒定。

1.2 主要試劑

Qiagen DNA提取試劑盒(51304，54161)購自凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司，OXIOD哥倫比亞血瓊脂(CM0031B)購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司，ABI熒光定量2×MIX(4369016)購自英濰捷基公司。

1.3 引物設(shè)計

從Genbank獲取巴爾通體RIBC基因序列，根據(jù)其保守片段設(shè)計特異引物和TaqMan探針，由TAKARA公司合成，引物及探針序列見表1。

表1 TaqMan實時熒光定量PCR方法引物與探針序列Table 1 Primers and probe used in TaqMan Real-Time PCR assay

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

使用基因工程技術(shù)構(gòu)建ABJ 1311重組質(zhì)粒，質(zhì)粒含長度為562 bp的目標(biāo)序列，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染工程菌，后細(xì)菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，特異性PCR鑒定，酶切鑒定結(jié)果正確，說明成功制備了標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。用紫外分光光度法測定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，在波長260 nm測吸光度A值，計算質(zhì)粒拷貝數(shù)，稀釋質(zhì)粒到1×1010copies/μL，分裝后-80 ℃凍存，用前進(jìn)一步稀釋。

1.5 熒光定量PCR方法反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

參考熒光定量PCR試劑盒說明書，建立擴(kuò)增貓巴爾通體的反應(yīng)體系(表2)，并進(jìn)行條件優(yōu)化，最終確定本實驗的反應(yīng)條件為：(1) 50 ℃ 2min (2) 95 ℃ 10 min (3) 95 ℃ 15sec，57 ℃ 1min，40 cycle。在每個循環(huán)的延伸結(jié)束時進(jìn)行熒光信號檢測。

表2 Real-time PCR反應(yīng)體系Table 2 The reaction system of Real-time PCR

1.6 樣本采集及DNA提取

無菌采集實驗用貓靜脈血500 μL，去血清后，吸取所有血塊用于提取DNA；對照菌株純培養(yǎng)后直接提取DNA，DNA提取使用天根的血塊提取試劑盒(Cat. DP335-02)，詳細(xì)操作根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.7 特異性測定

另取本室保存的菌種：肺鏈(31210)、肺鏈(36001)、乙鏈(32310)、小鼠放線(49577)、支敗(19395)、支敗(58401)、嗜肺(12555)、嗜肺(35149)、多殺(43137)、鼠棒(65013)、李斯特(54004)、支原體(MP)和支原體(15531)，按上述方法提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測不同細(xì)菌種間PCR擴(kuò)增的特異性。

1.8 敏感性測定

對照菌株純培養(yǎng)后，按上述方法直接提取DNA，將提取的DNA倍比稀釋為10 μg/mL、1 μg/mL、1.0×10-1μg/mL、1.0×10-2μg/mL、1.0×10-3μg/mL、1.0×10-4μg/mL、1.0×10-5μg/mL、1.0×10-6μg/mL、1.0×10-7μg/mL、1.0×10-8μg/mL、1.0×10-9μg/mL、1.0×10-10μg/mL，用上述PCR方法進(jìn)行測定，以確定其檢測閾值。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

使用分光光度計測定，并計算巴爾通體ABJ 1311質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)，拷貝數(shù)為1×1010copies/μL。根據(jù)測得的質(zhì)粒濃度，將ABJ 1311質(zhì)粒10倍系列稀釋，做10個稀釋度，作為模板進(jìn)行實時定量熒光PCR，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，1～10分別為10個稀釋度，分別為1.0×109copy/μL～1.0×100copy/μL。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線注：圖中紅色方塊為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。Fig.1 Standard curveNote：The red blocks stand for standard

2.2 熒光定量PCR方法的敏感性、特異性及穩(wěn)定性分析

為測定該P(yáng)CR方法的敏感性，選取漢賽巴爾通體(49882)培養(yǎng)液DNA提取物，使用無RNA酶水做10個稀釋度，從1.0×100copy/μL～1.0×109copy/μL，A～J為10倍系列稀釋結(jié)果，從圖2可見本實驗方法最高可檢測1.0×101copy/μL，靈敏度較好。圖3為特異性結(jié)果，我們用與巴爾通體毒種親緣關(guān)系較近的幾個菌株做對照，同時進(jìn)行熒光定量PCR方法的特異性分析，A～E為標(biāo)準(zhǔn)品，剩下的包括陰性對照、肺鏈(31210)、肺鏈(36001)、乙鏈(32310)、小鼠放線(49577)、支敗(19395)、支敗(58401)、嗜肺(12555)、嗜肺(35149)、多殺(43137)、鼠棒(65013)、李斯特(54004)、支原體(MP)和支原體(15531)，結(jié)果顯示，對照菌株均未見非特異性擴(kuò)增曲線的出現(xiàn)，即該P(yáng)CR方法的特異性較高。

圖2 熒光定量方法靈敏度結(jié)果Fig.2 The sensibility test

圖3 熒光定量PCR方法的特異性Fig.3 The specificity test

圖4 貓巴爾通體熒光定量PCR方法的應(yīng)用Fig.4 The result of samples from cat by the real-time PCR assay

2.3 使用巴爾通體實時熒光定量PCR方法檢測貓的感染情況

從北京采集142份貓血樣，提取DNA，并用優(yōu)化后的PCR方法擴(kuò)增特異性片段，以檢測是否存在巴爾通體的感染。在這些樣品中，發(fā)現(xiàn)其中4、6、7、18、32及57為陽性，如圖4所示。實驗用貓中巴爾通體的感染率為4.23%。

3 討論

巴爾通體(Bartonella))是一群革蘭氏染色陰性、營養(yǎng)條件要求苛刻、兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的需氧桿菌[9]。《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(2004)將之歸錄于變形菌綱、a亞綱、根瘤菌目、巴爾通體科、巴爾通體屬，列出21個種及亞種[10]。致病性巴爾通體有桿菌樣巴爾通體、五日熱巴爾通體、漢賽巴爾通體(B.henselae)、克氏巴爾通體(B.clarridgeiae)、伊麗莎白巴爾通體(B.elizabethae)等9種，可引起人類卡瑞恩病(carrion’s disease)、戰(zhàn)壕熱、貓抓病(cat scratch disease，CSD)、心內(nèi)膜炎、菌血癥和HIV感染者的桿菌性血管瘤(bacillary angiomatosis，BA)等疾病[9, 11]。人類可能因為與寄生巴爾通體的貓、狗等動物較為親近的接觸或偶然接觸自然環(huán)境中的嚙齒類等野生動物而感染巴爾通體或致病[10]。因此，對于攜帶巴爾通體的動物(如貓、狗)需要加強(qiáng)檢測和防范，避免不必要的動物源性感染和疾病的出現(xiàn)。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，貓在生物醫(yī)藥研究中的應(yīng)用越來越廣泛[3]。鑒于其獨特的生理特征，貓主要被用于神經(jīng)學(xué)、生理學(xué)和毒理學(xué)的研究。在某些研究中，如降壓實驗、弱視動物模型及高眼壓動物模型等，貓具有不可替代的作用[12]。貓還可較好地耐受麻醉和手術(shù)，而且手術(shù)時其能保持正常血壓。在藥品的降壓物質(zhì)檢查中，貓作為中國藥典規(guī)定的實驗動物。而且，貓越來越多地被用于形覺波剝奪性弱視、食管病、精子發(fā)育、卵泡發(fā)育等研究[3, 13-15]。因此，貓已具有成為實驗動物的潛力，而檢測其微生物背景為貓實驗動物化的前提和基礎(chǔ)。研究表明，4%～80%家貓攜帶有漢賽巴爾通體的抗體，10%～60%家貓感染了克氏巴爾通體，感染率存在明顯的地區(qū)差異及混合感染現(xiàn)象[16]。而且，1歲以下的小貓帶菌率比成年貓高。家貓帶菌可持續(xù)數(shù)周到幾年不等。因此，建立針對貓的巴爾通體檢測方法刻不容緩。

之前，大部分動物巴爾通體的調(diào)查研究使用的是細(xì)菌培養(yǎng)方法[17]，該方法為細(xì)菌檢測的經(jīng)典方法，但操作繁瑣，靈敏性低，時效性差。近來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及，也有部分實驗使用了PCR方法，陳武等人為快速準(zhǔn)確檢測華南虎感染的血巴爾通體種類，根據(jù)貓血巴爾通體的16S rRNA基因序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)華南虎感染的血巴爾通體為大型貓血巴爾通體[18]。姚美琳等人建立了靈敏、特異的SYBR-Green熒光定量PCR檢測巴爾通體的方法，以用于巴爾通體的實驗室快速診斷和自然疫源地的流行病學(xué)研究[19]。Sato等人使用巢氏PCR方法檢測了1754份貓血清樣品中漢賽巴爾通體和克氏巴爾通體的流行情況，發(fā)現(xiàn)4.6% (80/1754)樣品為PCR陽性，其中48.8% (39/80)為漢賽巴爾通體感染，33.8% (27/80)為克氏巴爾通體感染，17.5% (14/80)為共感染[20]。但由于巴爾通體的高度流行及基因型別的多樣性，有必要建立貓巴爾通體實時熒光定量PCR檢測方法。

本研究通過引物、探針設(shè)計，擴(kuò)增條件優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，靈敏性和特異性分析，成功建立了貓巴爾通體實時熒光定量PCR檢測方法，該方法線性范圍為1.0×101copies/μL～1.0×109copies/μL，相關(guān)系數(shù)為0.998，檢測極限達(dá)10 copies/μL，特異性良好；在142個實驗用貓樣品中檢測出陽性樣品6個。其次，本研究在北京來源貓中檢出巴爾通體，提示北京來源貓也存在巴爾通體的感染，而且相對其他動物，如姬鼠屬(Apodemus) (62.2%, 28/45)，家鼠屬(Rattus) (41.5%, 27/65)，絨鼠屬 (Eothenomys) (18.8%, 3/16)[21]，貓巴爾通體屬于低等程度流行(4.23%, 6/142)，鑒于實驗動物種群屬于高密度飼養(yǎng)，貓巴爾通體感染情況也應(yīng)該引起實驗動物科技界足夠的重視。因此，本研究建立了貓巴爾通體實時熒光定量PCR方法，為今后的貓病原檢測和動物實驗研究提供了有效的實驗手段，初步檢測了巴爾通體在北京地區(qū)貓群體中的流行情況，為貓的微生物檢測和貓的實驗動物化奠定基礎(chǔ)。