銅綠假單胞菌注射液對H22小鼠移植瘤的輔助治療效果*

饒子亮 鄭佳琳 黃 威 王 弋 潘詩云 黃綺玲 鄺少松

(1. 廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248)(2. 北京萬特爾生物制藥有限公司，北京 100000)

銅綠假單胞菌注射液(Pseudomonasaeruginosa-mannosesensitive hemagglutinin，PA-MSHA)是一種細菌類生物制劑，是以自然界中的銅綠假單胞菌為載體，通過基因工程技術表達出周身密布甘露糖敏感性血凝素菌毛的滅活疫苗(圖1)。在臨床上用于多種惡性腫瘤的輔助治療，能夠誘導腫瘤細胞凋亡、激活人體免疫反應，預防腫瘤的復發與轉移[1-2]。銅綠假單胞菌注射液作為腫瘤輔助治療藥物，目前聯合化療的協同效果缺乏實驗研究。本研究選取了H22小鼠移植瘤，驗證銅綠假單胞菌注射液聯合順鉑或阿霉素化療的輔助作用，為未來相關領域的研究提供實驗依據和數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼養條件

SPF級BALB/c小鼠55只，雄性，體質量14.5～16.9 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號：[SCXK(粵)2013-0002]，合格證號：0103987。

小鼠飼養在廣東省醫學實驗動物中心SPF級實驗動物室IVC系統內，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2013-0002，室內保持20～26 ℃，濕度40%～70%，采用10 h∶14 h晝夜間斷照明，自由飲水、進食，水料充足，SPF級飼料產自廣東省醫學實驗動物中心。實驗方案經廣東省醫學實驗動物中心實驗動物倫理委員會審查通過。

1.2 細胞

H22細胞購自中科院上海細胞庫。

1.3 主要試劑和儀器

主要儀器：倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司，型號：CKX41；超凈工作臺，蘇州凈化有限公司，型號：SW-CJ-2FD；恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司，型號：HWS-28；低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠，型號：TDL-5-A。

主要試劑：銅綠假單胞菌注射液，由北京萬特爾生物制藥有限公司提供；RPMI1640培養基，GIBCO公司生產；新牛血清，GIBCO公司生產；青/鏈霉素雙抗，杭州吉諾生物醫藥有限公司生產；胰酶，杭州吉諾生物醫藥有限公司生產；順鉑，南京制藥廠有限公司生產；鹽酸阿霉素，MBCHEM；生理鹽水，廣東利泰制藥股份有限公司生產。

圖1 銅綠假單胞菌對H22移植瘤的影響注:A組：空白對照；B組：銅綠假單胞菌組；C組：聯合順鉑組；D組：聯合阿霉素組；E組：順鉑組；F組：阿霉素組Fig.1 Effect of PA-MSHA on H22 transplanted tumorNote: A: blank control； B: Pseudomonas aeruginosa group；C: combined with cisplatin group；D: combined with adriamycin group；E: cisplatin group；F: adriamycin group

1.4 實驗方法

1.4.1接種：復蘇H22細胞，錐蟲藍染液染色計數，用 PBS配成濃度為1×l07個/mL的細胞懸液，于2只小鼠腹腔注射細胞懸液0.2 mL/只。7 d后，無菌取小鼠腹水，以PBS配成濃度為1×l07個/mL的細胞懸液，將檢疫合格的53只BALB/c小鼠先剪去左側腋下被毛，再用碘酒消毒，每只小鼠左側腋下注射0.2 mL的H22細胞懸液，每次注射前需混勻細胞懸液。

1.4.2分組：待大部分動物的腫瘤直徑長至約5 mm時，選取較均勻的48只動物，按腫瘤體積將小鼠隨機分為6組：空白對照、銅綠假單胞菌組、聯合順鉑組、聯合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組，8只/組。

1.4.3配制：銅綠假單胞菌注射液直接使用，無需配制，灌胃給藥前恢復至室溫；順鉑的配制：準確吸取1 mL的順鉑注射液，用生理鹽水定容至5 mL；阿霉素的配制：準確稱取2 mg阿霉素，加入10 mL生理鹽水，混勻。

1.4.4給藥：空白組灌胃給予PBS溶液；銅綠假單胞菌組灌胃給予PA-MSHA(1 000×108個/mL)溶液；聯合順鉑組灌胃給予PA-MSHA(1 000×108個/mL)溶液，同時腹腔注射順鉑(0.2 mg/mL)；聯合阿霉素組灌胃給予PA-MSHA(1 000×108個/mL)溶液，同時腹腔注射阿霉素(0.2 mg/mL)；順鉑組腹腔注射順鉑(0.2 mg/mL)；阿霉素組腹腔注射阿霉素(0.2 mg/mL)。每天灌胃給藥0.2 mL/10 g，隔天腹腔注射0.1 mL/10 g，連續給藥14 d。

1.4.5觀察：每天觀察動物1次，每周測量2次動物體質量；每周測量2次腫瘤長短徑，繪制腫瘤生長曲線；腫瘤體積按公式：V=1/2ab2測量計算，a、b分別表示長和寬；相對腫瘤增殖率T/C(%)計算公式如下：T/C%=TRTV/ CRTV×100%。(TRTV：治療組RTV；CRTV：陰性對照組RTV)。根據測量的結果計算出相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，計算公式為：RTV=Vt/ V0。其中V0為分籠給藥時(即0 d)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。

1.4.6實驗結束時，完整剝離腫瘤稱重，分組排列照相，計算腫瘤抑制率：腫瘤生長抑瘤率(%)=(空白對照組平均瘤質量-治療組平均瘤質量)/空白對照組平均瘤質量×100%。

1.5 數據處理

2 結果

2.1 銅綠假單胞菌聯合化療對一般臨床表現的影響

接種H22細胞后第4天，小鼠左背部皮下逐漸長出腫瘤。各組小鼠口、眼、耳、鼻均未見異常分泌物，精神狀態正常，大便無稀爛，尿量未見異常，尿液澄清透明。

2.2 銅綠假單胞菌聯合化療對體質量的影響

實驗結束時，與空白對照組比較，聯合順鉑組、聯合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組體質量顯著降低(P<0.05)，銅綠假單胞菌組體質量無顯著性變化(P>0.05)，見表1。

2.3 銅綠假單胞菌聯合化療對腫瘤體積的影響

實驗結束時，與空白對照組比較，聯合順鉑組、聯合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組的腫瘤體積顯著降低(P<0.05)，銅綠假單胞菌組的腫瘤體積無顯著性變化(P>0.05)，見表2。

表1 銅綠假單胞菌對H22移植瘤小鼠體質量的影響Table 1 Effect of PA-MSHA on body weight of H22 transplanted tumor

注：*表示與空白對照組比較，P<0.05，△表示與順鉑組比較P<0.05，▼表示與阿霉素組比較P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

表2 銅綠假單胞菌對H22移植瘤生長的影響Table 2 Effect of PA-MSHA on the growth of H22 transplanted

注：*表示與空白對照組比較P<0.05，△表示與順鉑組比較P<0.05，▼表示與阿霉素組比較P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

2.4 銅綠假單胞菌聯合化療對腫瘤質量的影響

與空白對照組比較，聯合順鉑組、聯合阿霉素組、順鉑組的腫瘤質量顯著降低(P<0.05)，阿霉素組的腫瘤質量無顯著性變化(P>0.05)，見表2和圖1。聯合順鉑組、順鉑組的抑瘤率為49.2%、46.6%，聯合阿霉素組、阿霉素組的抑瘤率為32.1%、19.8%，見表2。

2.5 銅綠假單胞菌聯合化療對臟器系數的影響

與空白對照組比較，聯合順鉑組、聯合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組的胸腺系數和脾臟系數顯著降低(P<0.05)；與順鉑組比較，銅綠假單胞菌組的胸腺系數和脾臟系數顯著增加(P<0.05)；與阿霉素組比較，銅綠假單胞菌組的脾臟系數顯著增加(P<0.05)，見表3。

表3 銅綠假單胞菌對H22移植瘤小鼠臟器系數的影響Table 3 Effect of PA-MSHA on organ coefficient of H22 transplanted tumor

注：*表示與空白對照組比較P<0.05，△表示與順鉑組比較P<0.05，▼表示與阿霉素組比較P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

3 討論

人類利用細菌治療腫瘤已有一百多年的歷史[3]。銅綠假單胞菌注射液是一種通過基因工程手段制備的銅綠假單胞菌生物制劑[4]，其不僅能有效激活人體的抗腫瘤免疫反應，還能直接誘導腫瘤細胞發生凋亡[5]，包括胃癌、肝癌、乳腺癌、腸癌、膀胱癌和神經膠質瘤等[6-8]。銅綠假單胞菌注射液是以自然界的綠膿桿菌為載體，通過基因工程技術表達出密布周身甘露糖敏感性(mannose sensitive hemagglutinin，MSHA)菌毛的制劑。傳統觀點認為，銅綠假單胞菌注射液是一種免疫增強劑，通過活化人體的細胞免疫和體液免疫反應，從而間接發揮抗腫瘤和抗感染的作用[9]。研究發現，其物質基礎是銅綠假單胞菌注射液菌毛上的甘露糖結合蛋白，該蛋白能與腫瘤細胞表面的甘露糖發生特異性結合，并產生兩方面的作用：① 靶向結合后改變腫瘤細胞的生物學行為，并誘導其凋亡；② 放大癌細胞的抗原信號，以刺激抗原遞呈細胞，幫助重建免疫監視功能，從而阻止腫瘤細胞進一步播散和轉移[8]。進一步的機理研究表明，銅綠假單胞菌注射液特有的MSHA 菌毛通過甘露糖分子的介導，阻斷細胞表面EGFR 受體的活化，從而導致惡性腫瘤細胞的凋亡，該理論稱為甘露糖通道途徑[10-13]。

銅綠假單胞菌制劑為我國學者自主研發，國內主要用于惡性腫瘤的輔助治療[14]。但其輔助治療效果如何，目前需要實驗數據的進一步支持。本次研究結果證實，銅綠假單胞菌注射液(1 000×108個/mL)對BALB/c小鼠一般狀態、體質量、腫瘤體積和腫瘤質量無顯著性影響；對H22小鼠移植瘤的直接抑制效果不明顯，對順鉑化療的輔助治療效果不明顯，對阿霉素化療的輔助治療有一定的增強效果；提高了脾臟系數，降低了胸腺系數。本實驗探討了銅綠假單胞菌注射液的輔助抗腫瘤活性，為未來相關領域和臨床研究打下了基礎。