MYH9基因Rs4821480位點單核苷酸多態性與IgA腎病病理及預后關系研究

田園青 張悅鳳 王彩麗

(天津市海河醫院，天津 300350)

IgA 腎病(IgA nephropathy，IgAN)是以反復發作性肉眼血尿或鏡下血尿，腎小球系膜區 IgA 沉積或以 IgA 沉積為主要特征的原發性腎小球疾病[1]。大部分觀點認為IgA在系膜沉積，活化補體，產生炎癥反應，該病與黏膜感染(呼吸道、腸道等)有關，與免疫和遺傳因素亦有一定相關性，可發生在任何年齡，伴有不同程度的蛋白尿、高血壓和腎臟功能受損，是導致終末期腎臟病的常見原發性腎小球疾病 。

IgAN是最常見的與6q22-23相關的腎小球腎炎[2]，是一種多基因疾病，人類白細胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)位于人類第 6 號染色體短臂 6p21.3區域，有研究認為系膜增生性IgAN與HLA-DRB1 基因多態性相關[3]。非肌性肌球蛋白重鏈9基因(Myosin heavy chain 9,nonmuscle,MYH9)位于人染色體22q12.3，被證實與非裔美國人慢性腎臟病相關[4,5](Chronic kidney disease，CKD)，包括局灶性節段性腎小球硬化癥[4,5](Focal segmental glomerular sclerosis，FSGS)、糖尿病(2型)腎病[6]、C1q腎病[7]和高血壓腎損害[5]等。本文通過PCR技術探討MYH9Rs4821480位點基因多態性與病理、預后關系。

1 材料與方法

1.1研究對象 IgAN組：腎穿刺活檢診斷為IgAN患者148例,并隨訪。

1.2實驗方法 外周靜脈血提取DNA，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法，MYH9基因總序列(chromosome:NCBI36:22:35006673:35114558:-1)上游引物5′-GCCACACAGAACAGAAAGC-3′，下游引物5′-GGCTGGCATTTAGTGTTGG-3′。擴增產物440 bp，酶切位點A、T。擴增條件： 94℃預變性180 s，94℃變性35 s，55℃退火45 s，72℃延伸55 s，共30個循環。72℃終末延伸10 min。酶切體系： PCR產物10 μl, DraⅠ內切酶0.5 μl、緩沖液2 μl、雙蒸水7.5 μl,370℃ 溫育箱過夜(12～13 h)，2%瓊脂糖4.0 g/dl溴乙錠凝膠方法電泳(電壓120 V,20 min)，紫外透射自動成像分析儀上進行成像。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0軟件，計量資料采用獨立樣本t檢驗(Independenttest)和單項方差分析(One-Way ANOVA),計數、等級資料比較采用χ2檢驗(Chi-Square test)，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank檢驗，多因素生存分析采用Cox模型，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1PCR擴增產物電泳結果 PCR擴增目的片段440 bp，酶切：①TT純合子，300 bp；②GT雜合子，440 bp、300 bp；③GG純合子，440 bp(圖1)。

2.2病理指標比較 計量資料腎病理免疫熒光IgA、C3，病理Hass分級在三種基因型間差異無統計學意義(表1、2)。

2.3基因型對腎功能影響分析 根據CCR水平(CCR<60 ml/min以及CCR≥60 ml/min)分組后作為應變量，將發病時年齡、基因型、Haas分級、血壓、蛋白尿程度等分別賦值作為自變量進行logistic回歸分析。結果表明年齡是腎臟損害加重的獨立危險因素(P=0.012,OR=1.375)(表3)，基因型則與腎功能進展無關。

圖1 基因型產物電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of genotypic productsNote: M.Marker(150 bp，240 bp，400 bp)；1，2.TT(300 bp)；3，4.GT(440 bp，300 bp)；5，6.GG(440 bp).

2.4基因型與預后的相關性分析 對148例患者進行隨訪，以腎穿為零點，CCr<15 ml/min或SCr增倍為終點事件。進行Kaplan-Meier生存分析整體比較(圖2)。TT基因型下降明顯(表4)；基因型組兩兩比較，GG基因型與TT基因型差異有統計學意義(表5)。

圖2 Kaplan-Meier生存分析Fig.2 Kaplan-Meier survival analysisNote: X10=Genotype，1=GG，n=14，2=GT n=39，3=TT n=3.

表1計量資料描述性比較

Tab.1Descriptivecomparisonofmeasurementdata

Measurement data GenotypeGG(n=30)GT(n=107)TT(n=11)Pathological immunofluorescence IgA2.48±0.672.70±0.672.63±0.52Pathological immunofluorescence C31.86±0.991.89±1.141.75±0.89

Note：One-way ANOVA analysisP>0.05.

表2等級資料比較

Tab.2Gradedatacomparison

Count grade dataGenotypeGGGTTTSex Male16527 Female14554Hematuria No493 Yes26755Hass pathological grade Level 1,210306 Level 3,4,52074524 proteinuria <1 g5253 ≥1 g 2067724 h proteinuria<1 g52531 g≤24 h proteinuria<3.5 g1244324 h proteinuria≥3.5 g8234

Note：Chi-Square test，P>0.05.

表3Logistic回歸統計結果

Tab.3Logisticregressionstatistics

Variable(B)(S.E.)WaldSig.Exp(B)95%CI for Exp(B)LowerUpperAge1.3360.5346.2700.0121)3.8041.33710.827Sex0.4260.6300.4580.4981.5320.4465.263Blood pressure0.4120.6980.3480.5551.5100.3845.935Urine protein0.6440.4462.0830.1491.9050.7944.570Hematuria 0.9620.6282.3470.1262.6170.7648.963HASS0.2820.3010.8790.3481.3250.7352.389Genotype0.3190.6060.2770.5991.3750.4194.509

Note：1)P=0.012<0.05.The confidence interval for correcting the regression coefficient 95% does not contain 1.

表4生存分析描述

Tab.4Survivalanalysisdescription

GenotypeNumber of each groupNumber of events atthe end pointCensored value (truncated value)Number of casesPercentage (%)GG1421285.7GT3973282.1TT32133.3Total56114580.4

表5生存時間兩兩比較

Tab.5Comparisonofsurvivaltime

GenotypeGGχ2(Log-Rank)PGTχ2(Log-Rank)PTTχ2(Log-Rank)PGG0.6890.4064.1060.0431)GT0.6890.4063.6200.057TT4.1060.0431)3.6200.057

Note：1)P<0.05.

表6Cox模型篩選的危險因素及參數估計

Tab.6RiskfactorsandparameterestimationofCoxmodelscreening

VariableBSEWaldSig.Exp(B)95.0% CI for Exp(B)LowerUpperAge-12.4066.1924.0140.0451)0.0000.0000.764Sex-1.6352.9830.3000.5840.1950.00167.473Blood pressure-2.0513.8310.2860.5920.1290.000234.736Urine protein-5.8257.2700.6420.4230.0030.0004 551.996Hematuria -3.4143.3181.0580.3040.0330.00021.979HASS-2.6101.1455.1950.0231)0.0740.0080.694CCR-4.6871.8016.7700.0091)0.0090.0000.315Genotype0.3704.8800.0060.9401.4470.00020 639.818

Note：1)P<0.05.

多因素對預后影響采用Cox比例風險模型進行分析，將對預后有影響的可能危險因素：發病年齡、CCR水平、蛋白尿程度、血壓、Haas分級、不同基因型等分別賦值作為自變量，得出結論：發病時年齡、CCR水平、Hass分級是影響腎病患者預后的獨立危險因素(P<0.05)(表6)。

3 討論

IgAN是由法國Berger于1968年首次提出的一種原發性腎小球疾病，最早認為預后良好，經過40余年研究發現，IgAN是一種慢性進展性疾病，20%～40%進展為終末期腎病，該病是由免疫復合物介導的腎小球腎炎，共同特征是免疫熒光下見到IgA在系膜區或伴沿毛細血管壁沉積[8]，可合并IgG、IgM及補體沉積。不同種類的免疫球蛋白沉積與臨床表現及組織損傷程度之間有一定的關系。單純IgA型組織損傷程度較輕，合并IgG及/或IgM沉積者,易合并補體沉積,提示其結合補體能力較單純IgA沉積強,因此造成腎組織相應損傷也較重,IgG、IgM及補體的沉積,可能參與IgAN的發生和發展[9]。然而迄今為止未找到與IgA抗體起反應的抗原物質，但治療上仍以抑制補體活化治療該病。IgAN臨床表現和預后多種多樣[10]，其發病機制尚不清楚，疾病進展速度與性別、年齡、是否合并腎性高血壓、尿蛋白程度均有一定的相關性，其中尿蛋白水平與 IgAN進展最為密切，其治療時應用激素或免疫抑制劑等也一定程度上參考蛋白尿水平，降低 IgA腎病患者的蛋白尿可以改善預后[11]。

IgAN腎活檢病理變化多樣，輕者光鏡下腎小球、腎小管基本正常，重者腎小球出現嚴重壞死性病變、新月體形成；腎小球硬化和腎小管萎縮/間質纖維化[12]，發展為臨床終末期腎病(ESRD)。不同病理分型的IgAN預后差異很大[13]。病理學家提出多種分類方法，但有一定局限性，未能獲得廣泛認同。目前較廣泛的IgAN分級系統包括WHO組織學分類法、Lee、Hass 分類法。目前國際上還沒有一個分級系統廣為臨床和病理醫生所接受，對各種病理改變的臨床意義還缺乏統一的認識，各個分級之間也很難達成一致。 國際 IgAN協作組和腎臟病理學會于2009 年建立了牛津病理分級標準。牛津病理分型方法強調 IgAN常見的病理指標，容易評估，較客觀反映腎活檢腎臟病變的動態變化，具有高度可重復性[14]，具備了將不同中心、不同病理醫師所得病理結果進行比較的基礎，各個病理指標與 IgAN臨床指標獨立相關[15]。但牛津分型是回顧性研究，病例選擇存在偏倚，中國病例數偏少，其合理程度及可操作性需進一步驗證。 Hass 分型屬于描述性分級，有研究結果提示 Hass分型級數越高，臨床腎功能越差，分級結果與臨床實驗室的檢查吻合度較高[16]。Hass 與 WHO分級方法的一致性較好[17]。結合以上，我們選擇Hass分級進行數據統計分析。

腎小球機械屏障濾孔由內層是毛細血管的內皮細胞、中層是非細胞性的基膜、外層是腎小球的上皮細胞組成，上皮細胞具有足突細胞，相互交錯的足突之間形成裂隙。裂隙上有一層濾過裂隙隔膜，是濾過的最后一道屏障。足突細胞及其相關的裂孔膜蛋白在蛋白尿發生和進展中發揮重要作用，受到國內外的重視[18]，Ghiggeri等[19]研究發現個體MYH9基因突變，腎活檢電鏡表現為局灶足細胞足突消失，足細胞裂孔隔膜缺失，足細胞受損。MYH9基因編碼非肌性肌球蛋白重鏈ⅡA (Nonmusclemyosin heavy chain ⅡA ,NMMHC-ⅡA) ，分子量約220 kD，主要在腎小球(特別是足細胞)、腎小管和小管周圍毛細血管表達,在近曲小管呈彌散分布，定位于腎小球足細胞和系膜細胞異常肌球蛋白聚集、破壞足細胞和腎小管上皮細胞細胞骨架，導致腎臟疾病進展， 有研究發現正常腎組織中 MYH9 不表達[20]。

但是我們通過研究MYH9基因Rs4821480位點基因多態性發現其基因型與IgAN病理HASS分級、病理指標、蛋白尿、鏡下血尿無關，考慮原因為該位點基因突變對足細胞的影響較小，但這只是推測，有待于加大樣本量進一步研究。對隨訪患者進行Kaplan-Meier生存分析比較，TT基因型下降明顯，生存時間比較，GG基因型與TT因型有統計學差異，這說明T等位基因可能引起腎功能惡化。這說明該基因多態性可能與腎臟疾病相關，直接導致腎臟疾病進展[4,5]。

IgAN的臨床病程與預后極不平衡，研究認為大量蛋白尿與血肌酐升高是不良預后的獨立危險因素，若IgAN表現為腎病綜合征、大量蛋白尿，或伴隨腎性高血壓，新月體形成，那么預后極為不佳，同時，嚴重的腎小球硬化與間質纖維化是病程進展的獨立危險因素[21]。

本研究發現該基因位點年齡、CCR、Hass分級與IgAN預后有關，與既往研究相同，但是MYH9基因該位點基因型與預后無明顯相關。 近期也有研究發現該基因SNP 并未見與ESRD有顯著關聯[22]，該研究結果與我國其他研究相似[23]需加大樣本量及隨訪量進一步研究。