血清miR-21及miR-155對急性腎損傷的診斷及預后評估價值①

鐘開義 黎寶仁 張祖文 藍 燕 蘇佩瓊 陳雪麗 蘇顯都

(海南西部中心醫院腎內科，那大 571799)

急性腎損傷(Acute renal injury，AKI)是一種由多種病因導致的、涉及多學科領域的臨床綜合征，其在危重癥患者中的發病率及病死率均較高，嚴重威脅著人類的生命健康[1,2]。微小核糖核酸(microRNA，miR)是一類小的非編碼RNA分子，廣泛參與細胞增生、凋亡、免疫炎性反應等多種機體生物學過程的調控[3]。近期的研究發現，miR-21及miR-155表達水平變化影響著腎細胞的增殖與凋亡，且與AKI的發生發展有關[4,5]。然而，關于血清miR-21及miR-155在AKI的早期診斷及預后評估的研究較少。本研究通過分析AKI患者血清miR-21及miR-155表達水平變化，并比較各指標對AKI患者的診斷及預后評估價值，旨在為尋找AKI新型診斷標志物及靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年9月海南西部中心醫院住院確診的AKI患者118例作為研究對象，其中男75例，女43例，年齡21～78歲，平均(46.53±13.26)歲。排除標準：①住院時間<24 h，年齡<18歲；②既往有慢性腎臟病史，曾服用過腎損害藥物，有尿路感染，接受過腎臟手術者；③惡性腫瘤，自身免疫性疾病者。另選擇同期50例體檢正常者作為對照組，其中男30例，女20例，年齡22～74歲，平均(44.85±10.43)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，并簽署患者知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1分組方法 AKI患者根據28 d的生存情況，將其分為存活組和死亡組。其中存活組76例，男47例，女29例，年齡(45.38±12.74)歲；死亡組42例，男28例，女14例，年齡(48.26±13.51)歲。記錄所有患者入院時的體質指數(Body mass index,BMI)、平均動脈壓、心率、體溫、基礎疾病、合并癥、急性生理學與慢性健康狀況評分系統Ⅱ(Acute physiology and chronic health scoring systemⅡ,APACHEⅡ)等基本資料。

1.2.2AKI診斷標準 參照2012《KDIGO急性腎損傷臨床實踐指南》[6]制定的AKI診斷標準：腎功能在48 h內突然減退，表現為血肌酐(sCr)絕對值升高≥26.5 μmol/L；或sCr較基礎值升高≥50%；或尿量減少，尿量<0.5 ml/(kg·h)，并持續>6 h。AKI分期：①AKI 1期：sCr升高達基線值的1.5～1.9倍，或升高值≥26.5 μmol/L，和(或)尿量<0.5 ml/(kg·h)，持續6～12 h。②AKI 2期：sCr升高達基線值的2～2.9倍；和(或)<0.5 ml/(kg·h)，持續≥12 h。③AKI 3期：sCr超過基線值3倍，或升高≥353.6 μmol/L或需要啟動腎臟替代治療，和(或)尿量<0.3 ml/(kg·h)，持續≥24 h，或無尿≥12 h。sCr檢測試劑由寧波美康生物科技股份有限公司提供(苦味酸法)。

1.2.3qRT-PCR檢測 抽取所有研究對象的空腹靜脈血3 ml于無抗凝劑管中，輕輕顛倒數次后靜置10 min，于室溫2 500 r/min離心15 min，分2層，吸取上層血清400 μl轉移至1個EP管中，-70℃保存。在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行實時定量PCR法(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)。參考血清microRNA快速提取試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)的使用說明書提取血清總microRNA。以U6為實驗內參,microRNA逆轉錄反應體系：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。于ABI 7500型熒光定量PCR儀中行擴增和熒光信號檢測，擴增條件為：95℃ 10 min 1個循環，95℃ 15 s、60℃ 60 s進行45個循環，實驗重復3次。每個反應體系中熒光信號達到所設定的閾值經歷的循環數即為Ct值，以U6為內參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-21及miR-155的相對表達水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

2 結果

2.1死亡組和存活組臨床一般資料比較 死亡組的sCr、APACHEⅡ評分明顯高于存活組，差異有統計學意義(P<0.05)；而兩組的性別、年齡、BMI、體溫、心率、基礎疾病、合并癥及平均動脈壓比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1死亡組和存活組臨床一般資料比較

Tab.1Comparisonofgeneralclinicaldatabetweendeathgroupandsurvivalgroup

ItemSurvival group(n=76)Death group(n=42)χ2/tPSex(male/female)47/2928/140.2720.602Age(year,x±s)45.38±12.7448.26±13.511.1860.190BMI(kg/m2,x±s)24.38±2.7524.92±3.160.5140.608Heart rate(time/mim,x±s)83.62±9.2784.75±8.520.5060.617Temperature(℃,x±s)37.40±0.8537.86±1.040.6480.529History of diabetes[n(%)]13(17.1)8(19.0)0.0700.792History of hypertension[n(%)]17(22.4)12(28.6)0.5620.454Complication[n(%)]0.4260.408Sepsis32(42.1)19(45.2)Seriously infect21(27.6)10(23.8)Operation15(19.7)9(21.4)Other8(10.5)4(9.5)Mean arterial pressure(mmHg,x±s)85.42±9.5083.28±9.160.6910.497sCr(μmol/L,x±s)215.62±138.43287.40±165.725.1030.006APACHEⅡ score(score,x±s)16.52±6.2822.36±7.358.204<0.001

GroupsnmiR-21miR-155Control group501.06±0.210.36±0.05AKI group1182.92±0.741)1.95±0.421)AKI 1 phase532.48±0.521)1.60±0.251)AKI 2 phase372.81±0.661)1.87±0.361)AKI 3 phase283.85±1.301)2)3)2.73±0.851)2)3)

Note：Vs control group,1)P<0.01；vs AKI 1 phase,2)P<0.01；vs AKI 3 phase,3)P<0.01.

2.2各組血清miR-21及miR-155表達水平比較 AKI組血清miR-21及miR-155表達水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。AKI 3期血清miR-21及miR-155表達水平明顯高于AKI 1期和AKI 2期，差異均有統計學意義(P<0.05)。AKI 2期血清miR-21及miR-155表達水平與AKI 1期比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3死亡組和存活組血清miR-21及miR-155表達水平比較 死亡組血清miR-21及miR-155表達水平明顯高于存活組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4血清miR-21、miR-155及二者聯合對AKI的診斷價值 血清miR-21及miR-155二者聯合診斷AKI的AUC(95%CI)為[0.932(0.874～0.993)]明顯優于miR-21[0.852(0.791～0.914)]和miR-155[0.826(0.764～0.890)]，差異均有統計學意義(Z=4.902、7.428，P<0.05)；血清miR-21診斷AKI的AUC(95%CI)與miR-155比較，差異無統計學意義(Z=1.108，P>0.05)。血清miR-21及miR-155診斷AKI的最佳界值分別為2.15、1.28，二者聯合診斷AKI的敏感度較好，為96.2%。見圖1和表4。

GroupsnmiR-21miR-155Survival group762.60±0.571.68±0.31Death group423.71±1.242.54±0.72t8.7356.419P<0.001<0.001

2.5血清miR-21、miR-155及二者聯合對AKI患者預后的評估價值 血清miR-21及miR-155二者聯合預測AKI死亡的AUC(95%CI)為[0.904(0.843～0.962)]明顯優于miR-21[0.836(0.778～0.898)]和miR-155[0.807(0.749～0.868)]，差異均有統計學意義(Z=4.673、7.105，P<0.05)；血清miR-21預測AKI死亡的AUC(95%CI)與miR-155比較，差異統計學意義(Z=0.964，P>0.05)。血清miR-21及miR-155預測AKI死亡的最佳界值分別為3.35、2.16，二者聯合預測AKI死亡的敏感度較好，為91.4%。見圖2和表5。

表4血清miR-21、miR-155及二者聯合對AKI的診斷價值

Tab.4DiagnosticvalueofserummiR-21,miR-155andtwoincombinationwithAKI

ItemOptimal cut-off valueStandarderrorAUC(95%CI)Sensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictivevalue(%)Negativepredictivevalue(%)positivelikelihoodratioNegativelikelihoodratioPmiR-212.150.0380.852(0.791-0.914)86.079.382.682.74.1550.177<0.001miR-1551.280.0450.826(0.764-0.890)83.577.080.479.63.6300.214<0.001Two combination -0.0160.932(0.874-0.993)96.278.381.693.54.4330.049<0.001

表5血清miR-21、miR-155及二者聯合對AKI患者預后的評估價值

Tab.5ValueofserummiR-21,miR-155andtwocombinedtoevaluateprognosisofAKIpatients

ItemOptimal cut-off valueStandarderrorAUC(95%CI)Sensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictivevalue(%)Negativepredictivevalue(%)positivelikelihoodratioNegativelikelihoodratioPmiR-213.350.0410.836(0.778-0.898)86.478.282.581.93.9630.174<0.001miR-1552.160.0480.807(0.749-0.868)82.074.677.378.63.2280.241<0.001Two combination-0.0250.904(0.843-0.962)91.475.878.688.53.7770.113<0.001

圖1 血清miR-21及miR-155診斷AKI的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum miR-21 and miR-155 in diagnosis of AKI

圖2 血清miR-21、miR-155及二者聯合評估AKI患者預后的ROC曲線Fig.2 Serum miR-21,miR-155,and two combined ROC curves for evaluating prognosis of AKI patients

3 討論

AKI是一種由不同病因所致的，以短時間內腎小球濾過率迅速下降為主要特點的臨床綜合征，對AKI的早期診斷和預后判斷是目前腎臟病學研究的熱點問題。microRNA是一種內源性的非編碼微小RNA，其廣泛存在于真核生物中，長度約為22個核苷酸，通過在轉錄后水平調控靶基因的表達，參與各種重要的生物學過程，如細胞增殖、分化和凋亡，病毒防御、腫瘤轉移、血管形成及免疫應答等[7，8]。已有研究證實，microRNA在疾病期間及其疾病的不同階段會出現表達量的變化，并且具有器官組織的表達特異性，因此microRNA具備作為疾病診斷標志物的特點[9]。最近的研究表明，miR-150的缺失可抑制心肌梗死誘導的小鼠急性腎損傷，同時緩解局部炎癥和間質細胞的凋亡，這種作用可能是通過激活胰島素樣生長因子1受體完成的[10]。Lorenzen等[11]研究發現，在小鼠缺血再灌注損傷模型和腎移植患者的腎臟內皮細胞和腎小管上皮細胞中存在miR-24的高表達，在這兩種細胞中過表達miR-24能夠加重缺氧誘導的細胞凋亡，miR-24通過調節組蛋白H2A家族成員X促進缺血再灌注損傷的發生發展。另有研究顯示，AKI患者miR-210表達水平較健康對照組明顯上調，Cox回歸及Kaplan-Meier曲線分析提示miR-210可以作為獨立預測AKI患者28 生存率的生物標志物，在組織缺血中表達上調的microRNA，在AKI患者血清中也呈高表達，在隨訪中發現AKI患者的生存期及預后與外周血microRNA的表達有關[12]。本研究顯示，AKI組血清miR-21及miR-155表達水平明顯高于對照組，AKI 3期血清miR-21及miR-155表達水平明顯高于AKI 1期和AKI 2期，死亡組血清miR-21及miR-155表達水平明顯高于存活組。提示血清miR-21及miR-155表達水平與AKI患者的病情嚴重程度相關，可能參與AKI的發生發展。Saikumar等[13]研究表明在缺血再灌注模型中miR-21及miR-155在腎臟皮髓質中均出現明顯變化，其中皮質中miR-155在24 h出現表達高峰，之后開始下降；而髓質中miR-21及miR-155的表達高峰出現在120 h，提示microRNA表達量變化與AKI相關。Du等[14]通過分析120例心臟體外循環術患者術后第1日早晨單個時間點的血漿和尿液中的miR-2l表達水平，發現miR-21表達量的上升程度與術后發生AKI的嚴重程度呈正相關性，甚至可以對患者是否需要行CRRT治療進行預測，顯示其具有診斷AKI的價值。由此可見，AKI的發生可能與細胞缺血缺氧、細胞凋亡等多種病理過程有關，miR-21及miR-155通過影響上述病理過程，產生細胞損傷作用，從而參與AKI的調控。

應用ROC曲線分析顯示，血清miR-21及miR-155診斷AKI的最佳界值分別為2.15、1.28，二者聯合診斷AKI的AUC優于miR-21或miR-155；血清miR-21及miR-155預測AKI死亡的最佳界值分別為3.35、2.16，二者聯合預測AKI死亡的AUC優于miR-21或miR-155。相關分析顯示，AKI患者血清miR-21水平與miR-155水平呈正相關。說明血清miR-21及miR-155對AKI的診斷及預后判斷具有一定的價值，二者聯合檢測有助于提高AKI診斷及預后判斷的準確性。Martino等[15]研究認為血漿miR-21水平并不隨著透析而下降，提示血漿miR-21可作為AKI早期診斷及病情進展的生物標志物，并可用于預測心臟術后AKI的預后情況。馬龍等[16]研究表明miR-21在腎缺血再灌注損傷的不同階段及不同缺血時間會發生不同程度的表達量變化，可能是一種較傳統生化指標更為優越的評估AKI的有效標志物。另有研究顯示，miR-155在腎缺血再灌注損傷中發揮重要作用，與信號通路有關，在疾病發生、發展的不同階段其表達譜亦存在差異[17]。由此可見，血清miR-21及miR-155水平與AKI的病情嚴重程度相關，有望成為一種新的AKI診斷、分類和預后判斷的工具。

綜上所述，血清miR-21、miR-155上調與AKI發生、發展有關，可作為AKI診斷及預后評估的新型生物標志物，二者聯合檢測有助于提高AKI診斷及預后評估的準確性，同時也為理解AKI發病機制及治療靶點提供了新的角度。但本研究仍存在很多局限性，如臨床試驗較少、檢測的microRNA數量少等，今后尚需更多系統的基礎性研究來進一步驗證。