alpha-1抗胰蛋白酶在 Stanford A 型主動脈夾層血管重構(gòu)中的作用及分子機(jī)制的研究①

李繼軍 夏利民 宋 凱 田愛麗 陸樹洋 亞爾麥麥提·穆薩 阿迪力江·居麥

(喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院心胸外科，喀什 844000)

主動脈夾層是心血管外科最為兇險的疾病，死亡率非常高，發(fā)病后病情進(jìn)展迅速，超過 20%的患者在入院接受治療之前即已發(fā)生主動脈夾層破裂死亡[1,2]。主動脈夾層的兇險程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腦梗、心梗和惡性腫瘤，已成為明顯影響人們健康的重要醫(yī)療和社會問題[3]。主動脈夾層的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，現(xiàn)多認(rèn)為主動脈夾層的發(fā)生是多種炎性細(xì)胞和炎性因子參與的以細(xì)胞外基質(zhì)降解及血管重構(gòu)為主要特征的病理過程，是遺傳、環(huán)境、血流動力學(xué)和免疫等多種因素共同作用的結(jié)果[4,5]。蛋白水解酶與蛋白酶抑制劑的平衡在維持血管壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，阻止血管壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)方面發(fā)揮了不可忽視的作用[6]。α-1抗胰蛋白酶(α-1anti trypsin,α1AT或AAT)是具有蛋白酶抑制作用的一種急性時相反應(yīng)蛋白，其主要功能是抑制多形核蛋白細(xì)胞釋放的溶酶體蛋白水解酶[7]。已有文獻(xiàn)報道，AAT缺乏與諸多肺部疾病密切相關(guān)[8,9]，如廖玉婷等[10]研究認(rèn)為，AAT主要通過抑制Caspase-3活性，可以有效保護(hù)肺內(nèi)皮損傷。還有研究報道AAT缺乏與慢性肝炎、肝硬化的發(fā)生密切相關(guān)[11]。尚有文獻(xiàn)提及，顱內(nèi)夾層動脈瘤發(fā)生與α-1抗胰蛋白酶缺乏有密切關(guān)系[12]。關(guān)于AAT在 Stanford A型主動脈夾層中的作用及分子機(jī)制，尚未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報道。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2012年4月～2016年4月在我院行手術(shù)治療的 Stanford A 型主動脈夾層患者8例、平均年齡(56.5±7.2)歲。升主動脈瘤患者8例、平均年齡(57.1±6.8)歲。正常組8例、平均年齡(56.8±6.6)歲。三組患者在年齡、性別等方面無統(tǒng)計學(xué)差異。

納入標(biāo)準(zhǔn)：收集所有在我院行手術(shù)治療的 Stanford A 型主動脈夾層、升主動脈瘤患者的升主動脈血管組織標(biāo)本，全血及血清標(biāo)本；正常血管組織標(biāo)本取自心臟移植患者供心修剪下來的升主動脈血管組織，血清標(biāo)本取自健康志愿者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：具有可以導(dǎo)致主動脈夾層明確病因機(jī)制的疾病，如馬凡綜合征、巨細(xì)胞動脈炎、大動脈炎、二葉式主動脈瓣畸形等，應(yīng)排除。

1.2方法

1.2.1組織收集 術(shù)中切除的部分升主動脈血管組織，經(jīng)生理鹽水反復(fù)將血漬漂洗干凈，采用銳利刀片沿血管的長徑及橫徑分別留取1 cm×0.5 cm 兩塊組織，使用傳統(tǒng)Trizol法提取血管組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后使用RT-qPCR法檢測組織中AAT基因表達(dá)水平。使用RIPA提取血管組織全蛋白，在蛋白水平檢測組織AAT水平。

1.2.2血清收集 用凝血管采集全血，采血后兩小時內(nèi)分離血清。使用AAT測定試劑盒檢測所有組別血清中AAT含量。

1.2.3人血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將手術(shù)中切下的帶有內(nèi)膜的升主動脈組織標(biāo)本無菌條件下轉(zhuǎn)移至超凈臺中，將其放至培養(yǎng)皿中，PBS 緩沖液反復(fù)清洗去除血漬。向培養(yǎng)皿中加入 0.25%的胰酶3～4 ml，將沖洗干凈的血管組織標(biāo)本內(nèi)膜浸漬在胰酶中1～2 min，收集消化液，采用 20%DMEM 等量液體中和胰酶，采用濾網(wǎng)過濾取出組織塊。收集到的內(nèi)皮細(xì)胞采用 20% DMEM 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃5%CO2培養(yǎng)箱。

1.2.4實驗分組 實驗分為胰酶干預(yù)組、MMP-2/9干預(yù)組及空白對照組，細(xì)胞接受前述干預(yù)因素處理前，一組細(xì)胞采用 AAT 預(yù)處理 12 h，另外一組采用 PBS 預(yù)處理做對照。72 h后收集細(xì)胞提取蛋白，檢測不同組別中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8、Caspase-3表達(dá)水平。

1.2.5Stanford A 型主動脈夾層動物模型的建立 采用比格犬作為實驗?zāi)Ｐ停┐坦蓜用}留置鞘管，隔日向血管腔內(nèi)注射 0.125%胰蛋白酶200 μl/kg，同時使用微量緩釋滲透泵皮下泵人 AngⅡ，較高劑量組1 000 ng/(kg·min)，持續(xù)灌注14 d；對照組泵入生理鹽水14 d。氯胺酮+地西泮(1∶1)麻醉比格犬后，暴露右側(cè)頸部及與右側(cè)腹股溝備皮、消毒，作長約2～3 cm切口，模型組背部皮下埋置AngⅡ緩釋泵，對照組埋置 0.9%氯化鈉緩釋泵。上述模型建立成功后，將實驗動物分為AAT干預(yù)組和生理鹽水對照組。采用靜脈注射人工合成AAT對實驗動物進(jìn)行干預(yù)，200 μl/kg隔日一次，持續(xù)14 d，對照組動物采用生理鹽水注射。

1.2.6病理學(xué)檢查 切取病變升主動脈血管組織，經(jīng)4%甲醛固定后，行HE染色和VG染色，觀察各組病變血管組織中炎性細(xì)胞浸潤情況，彈力膠原纖維分布情況等。另留取一部分血管組織作分子生物學(xué)檢測用。

1.2.7Caspase家族蛋白和基因檢測 使用RT-qPCR法和Western blot法從基因和蛋白表達(dá)水平上定量檢測經(jīng)過AAT干預(yù)處理后血管組織中的Caspase-8、Caspase-3的活性，比較各組間的差異。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理及分析，各組數(shù)據(jù)應(yīng)用方差分析、t檢驗及秩和檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同組別血管組織AAT mRNA表達(dá)水平 RT-PCR結(jié)果顯示AAT mRNA在不同組別中均有表達(dá)，AAT在升主動脈瘤患者血管中較正常人血管中表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，AAT在Stanford A 型主動脈夾層患者中表達(dá)水平有所下調(diào)(P<0.05)，且AAT在三組不同類型血管組織中具有差異性表達(dá)。結(jié)果見圖1所示。

2.2不同組別血管組織AAT 蛋白表達(dá)水平 兩組獨立Western blot結(jié)果顯示：在三種不同類型人血管組織中均有不同程度的AAT蛋白表達(dá)，其中在升主動脈瘤患者血管中AAT表達(dá)量最多，在Stanford A 型主動脈夾層中AAT較正常血管中略有下降。結(jié)果見圖2所示。

2.3三組不同類型人血清AAT含量比較 使用AAT血清測定試劑盒檢測不同組別人群血清中AAT含量，結(jié)果顯示：在升主動脈瘤患者血清中含有大量的AAT，與正常組相比具有顯著差異(P<0.05),同時，Stanford A 型主動脈夾層患者血清AAT含量有所下降同樣與正常組相比具有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果見表1所示。

2.4AAT 對血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制 使用Western blot檢測AAT預(yù)孵育后暴露于蛋白酶壓力下的原代血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果顯示：在對照PBS預(yù)孵育12 h的組別中，分別使用胰蛋白酶和MMP-2/9均能有效刺激激活Caspase家族蛋白Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)，其中MMP-2/9的刺激效果優(yōu)于胰蛋白酶的作用，使用AAT預(yù)孵育12 h后原代在MMP-2/9壓力的作用下，其組織表達(dá)的Caspase家族蛋白Caspase-3、Caspase-8較PBS預(yù)孵育組別中顯著下調(diào)。結(jié)果如圖3所示。

圖1 不同組別血管組織AAT mRNA表達(dá)水平Fig.1 Expression of AAT mRNA in vascular tissueNote: *.P<0.05.

圖2 不同組別血管組織AAT 蛋白表達(dá)水平Fig.2 Expression level of AAT protein in vascular tissue

2.5動物造模后血管組織Caspase家族mRNA表達(dá)水平比較 外界給予AngⅡ和胰蛋白酶后檢測動物血管組織Caspase家族蛋白基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示：僅使用AngⅡ緩釋造模后Caspase-3、Caspase-8 mRNA在AAT治療組明顯低于生理鹽水組，AngⅡ緩釋外加血管注射胰酶后，生理鹽水組Caspase-3、Caspase-8 mRNA顯著高于單純AngⅡ造模組，同時AAT治療組中Caspase-3、Caspase-8 mRNA顯著下降，結(jié)果如圖4所示。

表1三組不同類型人血清AAT含量比較

Tab.1ComparisonofserumAATcontentofdifferenttypesofpeople

GroupsAAT(mg/L)Normal group1 504.76±320.11Ascending aortic aneurysm2 613.28±434.09Stanford type A983.82±367.84

圖3 AAT保護(hù)MMP-2/9誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡Fig.3 AAT protects MMP-2/9 induced apoptosis of vascular endothelial cells

圖4 動物血管組織Caspase家族mRNA表達(dá)水平比較Fig.4 Comparison of mRNA expression level in Caspase family of animal vascular tissue

圖5 動物血管組織Caspase家族蛋白達(dá)水平Fig.5 Level of Caspase family albumen in animal vascular tissue

2.6動物造模后血管組織Caspase家族蛋白表達(dá)水平比較 外界在動物皮下緩釋AngⅡ和血管注射胰酶能夠有效誘導(dǎo)Stanford A 型主動脈夾層模型，結(jié)合細(xì)胞凋亡在Stanford A 型主動脈夾層中的重要作用，我們研究發(fā)現(xiàn)，單純給予AngⅡ雖能夠激活Caspase凋亡家族蛋白Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)，但是其刺激效果弱于AngⅡ聯(lián)合胰酶造模，同時給予AAT后，與對照組生理鹽水相比AAT在二者模型中均能有效降低Caspase-3、Caspase-8蛋白水平，差異顯著。結(jié)果見圖5所示。

3 討論

主動脈夾層是心血管外科最為兇險的疾病，死亡率非常高，發(fā)病后病情進(jìn)展迅速，其中A型主動脈夾層發(fā)病于升主動脈，累及升主動脈及降主動脈，A型主動脈夾層患者發(fā)病后3個月內(nèi)死亡率可達(dá)90%，遠(yuǎn)超過一般心腦血管疾病[1-3]。但是目前對于主動脈夾層的發(fā)病機(jī)制研究尚不清楚，患者血管組織炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥因子的大量釋放在血管夾層形成及發(fā)展中具有重要的作用。已有研究證明，血管重構(gòu)導(dǎo)致的血管內(nèi)膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)退行性病變、彈力纖維的減少以及平滑肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，都將促進(jìn)主動脈夾層形成[13]。同樣，蛋白酶和蛋白酶抑制劑的平衡在維持血管壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，阻止血管壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)方面發(fā)揮了不可忽視的作用。

α-1 抗胰蛋白酶(AAT)作為一種最主要的蛋白酶抑制物，其占血清中抑制蛋白酶活力的90%左右，AAT在血清中的含量對于機(jī)體具有重要的生理作用。已有文獻(xiàn)報道，AAT主要通過抑制Caspase-3活性，可以有效保護(hù)肺內(nèi)皮損傷[10]。我們研究發(fā)現(xiàn)AAT在A型主動脈夾層、主動脈瘤患者及正常人體血管中均有不同程度的表達(dá)，且在主動脈瘤患者血管組織中表達(dá)顯著上升，而在A型主動脈夾層患者中其AAT的表達(dá)較正常組顯著下調(diào)，其mRNA及蛋白水平的變化說明AAT在主動脈疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色，同時差異性表達(dá)有助于研究AAT在不同類型血管疾病中的作用。通過提取人體血管內(nèi)皮原代細(xì)胞，能夠在體外條件下模擬AAT對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)使用胰酶和MMP-2/9均能有效刺激內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，且MMP-2/9的刺激效果顯著優(yōu)于胰酶的作用,這一研究成果與Hu等[14]的結(jié)果相似。使用AAT預(yù)孵育12 h其對于Caspase家族蛋白Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)起顯著的抑制作用，說明AAT能夠通過抑制Caspase家族蛋白的激活進(jìn)而緩解胰酶或MMP-2/9引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。為了更進(jìn)一步研究AAT對于主動脈血管的保護(hù)作用，我們借鑒以往的實驗方案使用皮下緩釋AngⅡ和血管內(nèi)注射胰酶的方法在比格犬中制備主動脈夾層模型[15-17]，獲得動物模型后靜脈注射AAT治療后我們發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)動物模型中生理鹽水對照組同樣存在Caspase家族蛋白的激活表達(dá)和對應(yīng)mRNA表達(dá)水平的上調(diào)，這說明在動脈夾層模型體內(nèi)同樣存在Caspase家族蛋白Caspase-3、Caspase-8的激活，同樣在AAT干預(yù)治療組中Caspase-3、Caspase-8的基因和蛋白水平下調(diào)，說明AAT能夠通過抑制Caspase家族蛋白的激活進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，最終保護(hù)血管組織，阻止其形成動脈夾層。