青藤堿對阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠的保護作用及機制研究①

張家薇 薛 冰 崔正軍 郭鵬飛

(鄭州澍青醫學高等?？茖W校普外科，鄭州 450000)

肝臟是一種高度血管化的大器官，負責碳水化合物、蛋白質和脂類的代謝，從血液中去除藥物和毒素，并調節免疫反應。因此，肝臟經常受到各種各樣的威脅，尤其是各種治療性藥物的應用造成的負擔和損傷，甚至會導致肝細胞死亡和肝臟功能障礙等[1]。由處方藥、非處方藥及草藥引起的藥物性肝損傷是全世界肝病的主要原因[2]。藥物性肝損傷可以發展成各種形式的急性和慢性肝病[3]。大約20%的兒童急性肝衰竭病例都是由藥物性肝損傷造成的[4]。因此，藥物性肝損傷已成為一個亟待解決的健康問題，亦是臨床醫學和藥物開發的一大挑戰[5]。挖掘藥物性肝損傷的治療方法迫在眉睫。青藤堿是一種從中藥材青風藤中提取出來的異喹啉，在中國、日本及其他亞洲國家，青藤堿被廣泛應用于類風濕關節炎的治療，具有抗炎、抗血管新生、免疫抑制等功能[6,7]。研究表明，青藤堿還有利于其他多種疾病的治療，如癌癥、神經性疼痛、腦損傷等[8-10]。據報道p38及其下游分子HSP27在急性肝損傷中具有調控細胞凋亡和炎癥反應的功能[11,12]。本研究的主要目的是探索青藤堿對阿奇霉素誘導的大鼠急性肝損傷的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 30只6周齡SD大鼠購自中國科學院實驗動物中心。阿奇霉素(Azithromycin,AZM)和青藤堿(Sinomenine,SM)(貨號與規格：A7720～5 g，純度：HPLC≥98%)來源于Solarbio。蘇木素伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司。白細胞介素(Interleukin,IL)-6、IL-18和IL-1β的ELISA檢測試劑盒購自默沙克公司?？筀i67抗體、抗p38抗體、抗p-p38抗體、抗HSP27抗體和抗p-HSP27抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及藥物處理 SD大鼠隨機分為3組：對照組、阿奇霉素(AZM)組和阿奇霉素+青藤堿(AZM+SM)組。AZM組腹腔注射阿奇霉素(800 mg/kg)建立急性肝損傷模型，AZM+SM組予急性肝損傷大鼠腹腔注射青藤堿(20 mg/kg)，連續7 d。對照組用生理鹽水代替。

1.2.2HE染色 頸椎脫臼法處死大鼠后取出肝臟組織，去掉壞死組織及血凝塊。用4%的多聚甲醛在4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50%和70%的酒精依次脫水10 min。去除酒精并于脫水機中脫水，然后進行石蠟包埋和切片。按照HE染色液說明書進行HE染色。光鏡下觀察肝臟組織病變情況。

1.2.3TUNEL染色 石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后用蛋白酶K于20～37℃處理15～30 min。PBS漂洗3次后用3%的H2O2于室溫孵育20 min，隨后PBS清洗3次。然后按照試劑盒說明書進行生物素標記，顯色，蘇木素復染后自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。最后顯微鏡下觀察拍照，細胞核呈棕色顆粒的為凋亡細胞。

1.2.4免疫組化染色 石蠟切片經脫蠟再水化后用1% 的Triton-100處理15 min進行通透，再用3% 的H2O2處理15 min。5%的羊血清封閉30 min，再加入抗Ki67抗體，4℃過夜孵育，第二天加入對應的二抗(37℃,30 min)。最后進行染色封片觀察。

1.2.5ELISA 肝臟組織于PBS中進行勻漿后，4℃下15 000 g離心15 min。重復離心后取上清進行檢測。按照ELISA試劑盒說明書進行檢測，樣品加入反應孔37℃孵育45 min后用洗滌液洗滌4次，然后加入生物素標記的抗體37℃反應30 min，洗滌后加鏈霉親和素-HRP混勻37℃反應30 min。最后加入顯色劑避光顯色15 min，再加終止液終止反應，450 nm處檢測吸光值。

1.2.6蛋白印跡 首先用PBS將待測組織細胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，經5%的BSA封閉1 h后加入相應的一抗，4℃過夜孵育。第二天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液于凝膠成像儀進行曝光拍照并統計灰度值計算相對表達量。

1.3統計學分析 用SPSS16.0軟件對實驗數據進行統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1青藤堿對阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織病變的影響 通過HE染色觀察青藤堿對阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織病變的影響。圖1顯示，對照組肝臟組織細胞排列規則有序，無病理學變化。阿奇霉素組肝臟組織細胞排列不規則、充血、細胞質空泡化、肝細胞壞死。 阿奇霉素+青藤堿組肝臟組織病變得到明顯改善。上述結果表明，青藤堿可減輕阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織病變。

2.2青藤堿對阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織細胞凋亡的影響 為分析青藤堿對阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織細胞凋亡的影響，利用TUNEL檢測細胞凋亡。如圖2所示，阿奇霉組肝臟組織細胞凋亡明顯高于對照組(P<0.05)。與阿奇霉素組相比，阿奇霉素+青藤堿組細胞凋亡明顯降低(P<0.05)。由此可見，青藤堿可抑制阿奇霉素誘導的大鼠肝臟組織細胞凋亡。

圖1 HE染色觀察肝臟組織病變(×100)Fig.1 Pathological changes of liver tissues was observed by HE staining(×100)

2.3青藤堿對阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織細胞增殖的影響 免疫組化染色檢測青藤堿對阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織增殖相關蛋白Ki67表達的影響。由圖3可知，阿奇霉素組肝臟組織Ki67表達明顯低于對照組(P<0.05)。阿奇霉素+青藤堿組Ki67表達明顯高于阿奇霉素組(P<0.05)。以上結果說明，青藤堿可減弱阿奇霉素介導的對大鼠肝臟組織細胞增殖的抑制作用。

圖2 TUNEL檢測細胞凋亡Fig.2 Apoptosis was detected by TUNELNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs AZM group.

圖3 免疫組化染色檢測Ki67表達Fig.3 Expression of Ki67 was tested by immumohistoche-mical stainingNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs AZM group.

2.4青藤堿對阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織炎癥反應的影響 通過ELISA檢測促炎因子IL-6、IL-18和IL-1β水平，分析青藤堿對阿奇霉素誘導的大鼠肝臟組織炎癥反應的影響。圖4顯示，阿奇霉素組肝臟組織IL-6、IL-18和IL-1β水平明顯高于對照組(P<0.05)。與阿奇霉素組相比，阿奇霉素+青藤堿組IL-6、IL-18和IL-1β水平明顯下降(P<0.05)。上述結果表明，青藤堿可減輕阿奇霉素誘導的大鼠急性肝損傷導致的肝臟組織炎癥反應。

2.5青藤堿對阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織p38信號通路相關蛋白表達的影響 為進一步分析青藤堿影響阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠的分子機制，蛋白印跡檢測p38信號通路相關蛋白表達。如圖5所示，阿奇霉素組肝臟組織p-p38/p38和p-HSP27/HSP27比值明顯高于對照組(P<0.05)。與阿奇霉素組相比，阿奇霉素+青藤堿組p-p38/p38和p-HSP27/HSP27比值明顯降低(P<0.05)。由此可見，青藤堿可減弱阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織p38和HSP27磷酸化水平的升高，抑制p38信號通路的激活。

圖4 ELISA檢測炎癥因子水平Fig.4 Levels of inflammatory factor were detected by ELISANote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs AZM group.

圖5 蛋白印跡檢測p38信號通路相關蛋白表達Fig.5 Expression of p38 pathway related proteins was measured by Western blotNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs AZM group.

3 討論

急性肝損傷是一種常見的臨床現象，起因于各種不同的病因，如藥物、毒素、缺血/再灌注和病原體等。急性肝損傷中常常會引起免疫反應和肝細胞凋亡等，最后甚至發展為急性肝衰竭。急性肝衰竭具有很高的死亡率，往往需要進行肝移植[1]。治療急性肝損傷是人類醫療衛生健康系統的重大課題。越來越多的研究表明許多天然產物在治療急性肝損傷方面發揮著積極作用。

大量文獻報道多種植物提取物具有改善肝臟組織病變的功效。研究表明香茅草提取物可改善H2O2誘導的大鼠肝臟組織充血、浸潤、細胞質空泡化和肝細胞變性等病變[13]。波棱瓜提取物可減輕四氯化碳誘導的小鼠肝臟組織浸潤及肝細胞變性等組織病變[14]。Liu等[15]發現楊梅提取物中的黃酮類化合物可改善酒精誘導的小鼠肝臟組織水腫、脂肪變性等病變。本文研究結果顯示，青藤堿可減輕阿奇霉素誘導的急性肝損傷，改善大鼠肝臟組織肝細胞排列不規則、充血、細胞質空泡化和肝細胞壞死等病變。

細胞凋亡在各類疾病中具有重要作用，許多植物提取物都可調控細胞凋亡。有研究發現丹參和紅花提取物可降低脂多糖誘導的小鼠肝臟組織肝細胞凋亡的增加[16]。研究表明青藤堿可抑制缺血損傷小鼠腦組織細胞凋亡[17]。另外，青藤堿還可減弱慢性哮喘小鼠模型中肺部氣道上皮細胞凋亡的增加[18]。Shi等[19]發現青藤堿可促進腦內出血小鼠神經元活力，抑制神經元凋亡。本文結果顯示，青藤堿可抑制阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織細胞凋亡的增加和Ki67表達的降低。

越來越多的研究表明多種植物提取物都具有抗炎的作用。據報道南非博士茶提取物可抑制脂多糖誘導的大鼠肝臟組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平的上升[20]。在對乙酰氨基酚誘導的肝損傷小鼠中，馬齒莧提取物可降低肝臟組織IL-6和TNF-α水平的釋放[21]。有研究發現青藤堿可減弱白蛋白誘導的過敏性鼻炎小鼠IL-4和IFN-γ水平的上升[22]。另外，青藤堿還可抑制佐劑性關節炎大鼠和膠原誘導性關節炎大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平的升高[23,24]。本研究結果顯示，青藤堿可降低阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠IL-6、IL-18和IL-1β水平的升高，具有明顯的抗炎作用。

p38信號通路在各類細胞進程中發揮重要作用，許多植物提取物都可以調節p38信號通路。據報道銀杏葉提取物可通過調節p38信號通路改善四氯化碳誘導的小鼠肝臟纖維化和細胞凋亡[25]。Liu等[26]發現在脂多糖/半乳糖胺誘導的急性肝衰竭小鼠中，沙棘提取物可抑制p38磷酸化水平的升高。有研究顯示青藤堿可通過降低p38磷酸化水平的升高抑制脂多糖誘導的破骨細胞生成和骨質溶解[27]。有數據表明在缺血再灌注腎損傷小鼠中，青藤堿可降低p-p38/p38比值的升高[28]。本文結果顯示，青藤堿可減弱阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織p38和HSP27磷酸化水平的升高，抑制p38信號通路的激活

本研究表明，在阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠中，青藤堿可改善肝臟組織病變，抑制細胞凋亡的增加和Ki67表達的降低，減輕IL-6、IL-18和IL-1β水平的升高，減弱p38和HSP27磷酸化水平的上升。綜上所述，在阿奇霉素誘導的急性肝損傷大鼠中，p38信號通路活化會導致炎癥因子的產生和肝細胞凋亡，從而導致肝損傷的發生；青藤堿可通過干預p38信號通路的活化發揮保護作用。下一步計劃研究青藤堿對缺血再灌注等其他因素引起的急性肝損傷的影響，為急性肝損傷的治療奠定理論基礎。