HOXD10基因抑制結直腸癌細胞生長的機制研究

郗昌磊 龔治林 周啟昌 于 杰 葉 輝 曹龍磊 王沛云

(荊州市中心醫院肛腸外科,荊州 434020)

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近些年的發病率呈現出上升的趨勢，其發生發展是一個多基因、多步驟的復雜過程，涉及抑癌基因、癌基因、信號通路等的變化，研究引起結直腸癌發生的分子機制對于該病的診療具有重要意義[1]。HOXD10基因是同源異形盒基因家族中的一員，可通過對腫瘤的增殖、轉移、侵襲等機制進行調節而發揮抑癌作用[2]。有研究表明，在乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中HOXD10的表達減少，并在上皮來源的腫瘤轉移及侵襲中發揮重要作用[3,4]。而過表達HOXD10可降低鼻咽癌細胞的侵襲及遷移能力[5]。HOXD10在結直腸癌中的研究相對較少，有研究顯示，結直腸癌中HOXD10的低表達與腫瘤的浸潤轉移存在密切聯系，miR-10b可通過靶向HOXD10促進結直腸癌細胞的侵襲[6,7]，過表達HOXD10對結直腸癌細胞增殖凋亡、免疫的影響及機制研究得尚未清楚。本研究通過將過表達HOXD10的質粒轉染結直腸癌細胞，旨在研究其對細胞增殖、凋亡、免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達及Notch信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 DMEM培養基、胎牛血清均購自美國Bibco；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen；pcDNA3.1真核表達載體購自天根生化有限公司；MTT試劑購自日本DOJINDO；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自南京凱基；HOXD10、TGF-β1、VEGF、Notch1、Jagged1和Hes1抗體均購自美國SANTA CRUZ；酶標儀購自上海拜格生物；流式細胞儀購自美國BD。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染 人正常結腸NCM460細胞及結直腸癌HCT116、HT29、CaCO2細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于5%體積分數的CO2培養箱中37℃培養。實驗選擇生長狀態良好的細胞。轉染前1 d在6孔板的每孔中接種1×106個HT29細胞，細胞達90%匯合時，參照脂質體LipofectamineTM2000轉染說明進行轉染，隨機將細胞分為三組，陽性轉染組(pcDNA3.1-HOXD10組)取質粒2 μg質粒加入250 μl的DMEM培養基中，獲得A液，取4 μl的LipofectamineTM2000加入250 μl的DMEM培養基中獲得B液，室溫靜置5 min，混勻A液和B液，室溫靜置20 min，將混合液均勻的滴加在細胞培養基中，輕輕晃動以使混合均勻，陰性對照組(pcDNA3.1組)轉染pcDNA3.1空質粒2 μg，操作同pcDNA3.1-HOXD10組，同時設置加入原培養液的為空白對照組，轉染后培養48 h，用于后續實驗研究。

1.2.2蛋白質印跡(Western blot) 采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，Bradford法對蛋白濃度進行檢測，取總蛋白40 μg上樣，經12%的SDS-PAGE，電泳后將凝膠取出，轉印儀將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉轉好的膜1 h，加入稀釋好的HOXD10、TGF-β1、VEGF、Notch1、Jagged1和Hes1抗體(皆為1∶1 000稀釋)，4℃搖床孵育過夜，洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，ECL顯色，凝膠成像系統進行結果觀察。以GAPDH作為內參，實驗重復3次。

1.2.3MTT法檢測細胞活力 接種生長至對數期的HT29細胞(5×104個/ml)于96孔板，每孔中加入100 μl，常規培養過夜，按照1.2.1分組及方法轉染，每組設置5個重復孔，收集轉染48 h的細胞，每孔加20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，培養箱中37℃培養4 h停止培養，將培養液棄去，加入150 μl的DMSO溶液在每個細胞孔中，振蕩10 min，酶標儀檢測各孔吸光度值(OD值，570 nm)。實驗重復3次。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 收集轉染48 h的細胞，PBS洗滌細胞，收集(1～5)×105個細胞，500 μl的Binding緩沖液懸浮細胞，加入FITC標記的Annexin V 5 μl，充分混勻后加入PI 5 μl，混勻后避光條件室溫反應5～15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

2 結果

2.1結直腸癌細胞HOXD10的表達 HOXD10在結直腸癌細胞的蛋白表達如圖1所示，結直腸癌HCT116、HT29、CaCO2細胞中HOXD10的表達均顯著低于在NCM460細胞表達(P<0.05)。

2.2轉染效果 pcDNA3.1-HOXD10轉染HT29細胞48 h，Western blot檢測各組細胞HOXD10的蛋白表達，結果如圖2所示，轉染 pcDNA3.1-HOXD10的HT29細胞HOXD10表達顯著高于空白對照組(P<0.05)，而pcDNA3.1組和空白對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 HOXD10在結直腸癌細胞的蛋白表達Fig.1 Protein expression of HOXD10 in colorectal cancer cellsNote: A.HOXD10 protein expression electrophoresis map;B.HOXD10 protein relative expression quantity;compared with NCM460 cell,*.P<0.05.

2.3過表達HOXD10抑制HT29細胞活力 各組細胞活力檢測結果如圖3所示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HOXD10組細胞活力顯著降低(P<0.05)。

2.4過表達HOXD10誘導HT29細胞凋亡 各組細胞凋亡率檢測結果如圖4所示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HOXD10組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

2.5過表達HOXD10下調HT29細胞免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達 各組細胞中免疫抑制因子VEGF和TGF-β1的蛋白表達結果如圖5所示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HOXD10組VEGF和TGF-β1的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。

圖2 pcDNA3.1-HOXD10轉染HT29細胞的效果Fig.2 Effect of pcDNA3.1-HOXD10 transfection on HT29 cellsNote: A.HOXD10 protein expression electrophoresis map;B.HOXD10 protein relative expression quantity;compared with blank control group,*.P<0.05.

圖3 過表達HOXD10對HT29細胞活力的影響Fig.3 Effect of overexpression of HOXD10 on activity of HT29 cellsNote: Compared with the pcDNA3.1 group,*.P<0.05.

2.6過表達HOXD10下調HT29細胞Notch信號通路 Western blot檢測各組細胞Notch信號通路受體Notch1、配體Jagged1及下游靶基因Hes1的蛋白表達，結果如圖6所示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HOXD10組Notch1、Jagged1和Hes1的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。

圖4 過表達HOXD10對HT29細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of overexpression of HOXD10 on apoptosis of HT29 cellsNote: A.Flow cytometry results;B.Apoptosis rate of each group;compared with pcDNA3.1 group,*.P<0.05.

圖5 過表達HOXD10對HT29細胞免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達的影響Fig.5 Effect of over expression of HOXD10 on expression of VEGF and TGF-β1 in HT29 cellsNote: A.The expression of VEGF and TGF-β1 protein electrophoresis;B.The relative expression of VEGF and TGF-β 1；compared with pcDNA3.1 group,*.P<0.05.

圖6 過表達HOXD10對HT29細胞Notch信號通路的影響Fig.6 Effect of overexpression of HOXD10 on Notch signaling pathway in HT29 cellsNote: A.Protein expression electrophoresis map;B.Relative expression of protein;compared with pcDNA3.1 group,*.P<0.05.

3 討論

結直腸癌的發生發展與其相關的抑癌基因、原癌基因、信號轉導通路等密切相關，目前已發現多個可用于診療結直腸癌的分子靶點，但仍需尋找更多有效的靶點。HOX基因分為HOXⅠ類和HOX Ⅱ類基因，其中人的HOX基因家族屬于HOXⅠ類基因，有HOXA/B/C/D四個簇，近些年的研究發現HOX基因影響多種實體腫瘤的發生及發展[8,9]。HOXD10是HOX基因家族中的一個成員，在腫瘤中的研究相對較少。有研究表明，腫瘤中HOXD10表達缺失或降低，可能發揮抑癌作用[10,11]。如胃癌中HOXD10表達降低，過表達HOXD10可抑制細胞的增殖和侵襲、克隆形成、阻滯細胞周期及誘導細胞凋亡[12]；miR-224通過靶向HOXD10調控下游相關分子而影響肝癌細胞的遷移及侵襲能力[13]。結直腸癌中HOXD10的研究相對較少，有研究發現結直腸癌中HOXD10的低表達與腫瘤的浸潤轉移存在密切聯系，miR-10b可通過靶向HOXD10促進結直腸癌細胞的侵襲[6,7]，過表達HOXD10對結直腸癌細胞生物學特性的影響及機制研究的尚未清楚。

本研究中首先檢測不同結直腸癌細胞中HOXD10的表達，發現在HT29細胞中HOXD10的表達最低，因此選擇作為研究對象。通過將過表達HOXD10的質粒轉染HT29細胞，發現HOXD10的表達明顯升高，說明過表達HOXD10的HT29細胞建立成功，且發現過表達HOXD10可明顯抑制HT29細胞活力和誘導細胞凋亡。這提示過表達HOXD10可影響結直腸癌的發生發展。Notch信號通路是一種重要的信號轉導通路，不僅影響細胞正常發育、增殖分化和凋亡，且影響多種腫瘤的發生發展，由Notch受體、配體及核內結合蛋白和靶基因組成，在多種腫瘤中Notch信號通路處于激活狀態，如結直腸癌、乳腺癌等，而抑制Notch信號通路可降低腫瘤的發生發展[13-15]。TGF-β是一組多能效生長抑制因子，具有非常廣泛的生物學活性，參與組織發育、免疫反應等過程，發揮免疫抑制作用，可介導結直腸癌的免疫逃逸[16,17]。有研究顯示，抑制Notch信號通路可逆轉TGF-β1誘導的肺癌的EMT轉變[18]，血管內皮細胞生長因子(VEGF)是調控腫瘤血管生成的一個重要因素，多種腫瘤中呈現高表達，抑制其表達可降低乳腺癌、結直腸癌等腫瘤的增殖和誘導凋亡[19,20]。在研究腎母細胞瘤中發現，細胞加入Notch信號通路抑制劑可抑制Notch信號通路及明顯降低VEGF的表達[21]。本研究結果顯示，過表達HOXD10可明顯降低TGF-β1、VEGF和Notch信號通路受體Notch1、配體Jagged1及下游靶基因Hes1的蛋白表達，這提示過表達HOXD10可能通過下調Notch信號通路影響結直腸癌的發生發展。

綜上所述，上調結直腸癌細胞HOXD10基因表達可抑制癌細胞活力，誘導細胞凋亡，下調免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達，機制可能與下調Notch信號通路有關。本研究可能為結直腸癌的分子靶向治療提供了一定的理論基礎，但本研究檢測的內容有限，值得進一步深入在體內及體外進一步研究。