枯草芽孢桿菌 ATCC9372產(chǎn)生海藻酸寡糖通過T輔助細(xì)胞2型相關(guān)細(xì)胞因子能有效抑制哮喘發(fā)作的研究

沙尚清 尹 梅 韓學(xué)梅 楊春霞 舒 紅

(寧夏醫(yī)科大學(xué)銀川醫(yī)院呼吸內(nèi)科，銀川 750000)

哮喘又名支氣管哮喘是一種普遍的嚴(yán)重危害人類健康的疾病，發(fā)病率逐年增高，治療十分棘手[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2015年發(fā)布的哮喘資料顯示，全世界大約有2.55億人患有哮喘。 2013年一份報告顯示，僅中國就大約有2 000萬哮喘患者，其中16歲以下的未成年人和60歲以上的老人發(fā)病率更高[2]。較10年前的調(diào)查結(jié)果分別增高了117.8%和160.9%[3]。哮喘誘發(fā)劑有許多，如室內(nèi)和室外過敏原、病毒感染和污染。寵物皮屑和蟑螂是室內(nèi)過敏原，花粉、霉菌和真菌是室外過敏原。煙草煙霧、化學(xué)刺激物和空氣污染是污染物[4，5]。 哮喘的典型臨床癥狀包括咳痰、杯狀細(xì)胞增生、上皮細(xì)胞脫落、基底膜增厚、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。 這些癥狀最終導(dǎo)致氣道阻塞。哮喘發(fā)病機制較為復(fù)雜，有研究表明氣道慢性炎癥是哮喘的本質(zhì)，其中Th1/Th2表達失衡，即Th1功能不足與Th2功能亢進是氣道慢性炎癥發(fā)生的基礎(chǔ)[6]。臨床研究報道，在哮喘患者中Th1/Th2失衡直接源于其上游轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞T盒蛋白(T-box expressed in T cells，T-bet)/GATA結(jié)合蛋白(GATA-binding protein，GATA)-3平衡失調(diào)，動物實驗研究結(jié)果表明，Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet基因缺失可導(dǎo)致小鼠自發(fā)出現(xiàn)哮喘樣氣道炎癥的表現(xiàn)[1，7，8]。 T-bet是控制Th1增殖的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過IFN-γ和 IL-12相互作用可以增加Th1的表達，GATA-3是控制Th-2增殖的轉(zhuǎn)錄因子[9]。支氣管擴張劑，如皮質(zhì)類固醇、白三烯調(diào)節(jié)劑、茶堿等藥物目前用于哮喘的治療，但是療效甚微。大劑量皮質(zhì)類固醇的吸入是控制哮喘發(fā)作的常用方法[10-13]。 然而，這種治療方法有很大的副作用，往往會降低糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合親和力以及T細(xì)胞反應(yīng)[14]。 因此，越來越多的研究致力于從天然產(chǎn)物和傳統(tǒng)藥物中尋找治療哮喘的藥物。海藻酸鈉是海藻莖上的一種黏性物質(zhì)[15]。已被用作抗慢性潰瘍性結(jié)腸炎的抗炎劑以及抗氧化劑。 也被用于封裝材料和微針結(jié)構(gòu)。已有研究表明海藻酸寡糖(Alginate oligosaccharides，AO)可以克服耐藥性，增強抗生素的作用，并能用于高鹽飲食誘導(dǎo)的大鼠高血壓模型的治療[16]。 盡管很多研究證實了AO的抗炎和抗氧化特性，但其在治療哮喘中的作用尚不清楚。 因此，本研究主要研究了由枯草芽孢桿菌ATCC9372產(chǎn)生的AO對卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型的治療作用[6]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 32只健康8周齡的SPF級小鼠雌雄各半，體重20 g，購自揚州大學(xué)實驗動物中心。12 h晝夜交替，給予充足的水和食物飼養(yǎng)。按照實驗要求隨機分為4組，每組8只(n=8)，分別為正常對照組、OVA誘導(dǎo)哮喘模型組、海藻酸寡糖(AO)低劑量治療組：50 mg/kg和海藻酸寡糖(AO)高劑量治療組：200 mg/kg。

1.1.2藥物 雞卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)購自上海朗頓生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌購自北京金四環(huán)科技有限責(zé)任公司。

1.1.3試劑及儀器 光學(xué)顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；-20℃低溫冰箱購自北京福意電器有限公司；低溫高速離心機購自H2050R-1湖南湘儀離心機有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和流式細(xì)胞儀購自Thermo Fisher Scientific公司；Amicon過濾器購自Sigma公司；PE標(biāo)記的家兔抗小鼠干擾素(Interferon，IFN)-γ購自上海生物工程有限公司；IL-4購自南京建成生物工程研究所；小鼠β-肌動蛋白(Actin)檢測引物由上海生工生物工程有限公司合成；山羊抗小鼠CD3、CD8、CD68和CD4均購自武漢谷歌生物科技有限公司； NaCl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2和水合氯醛購自上海試一化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母提取物和海藻酸購自偃師市百家工貿(mào)有限公司；甘露糖醛酸寡糖DP5購自法國ELICITYL SA公司。

1.2方法

1.2.1模型制作及給藥方法 ①OVA誘導(dǎo)哮喘模型組：第1～8天小鼠腹腔注射40 mg/L OVA抗原溶液0.5 ml、1 mg氫氧化鋁水合物進行致敏反應(yīng)；然后于第21～25天連續(xù)5 d用10%水合氯醛按照3 ml/kg 腹腔注射麻醉小鼠后，使用噴霧器將5%OVA溶液噴鼻30 min激發(fā)；②正常對照組：采用無菌生理鹽水代替OVA溶液；③海藻酸寡糖(AO)50 mg/kg組：采用上述方法建立哮喘模型，在誘導(dǎo)哮喘的第25～29天，將海藻酸寡糖(AO)按照50 mg/kg劑量每天進行一次灌胃，時間間隔24 h；④海藻酸寡糖(AO)200 mg/kg組：方法同海藻酸寡糖(AO)50 mg/kg 組，第25～29天將海藻酸寡糖(AO)以200 mg/kg 劑量每天進行一次灌胃，時間間隔 24 h。4組小鼠最后一次灌胃治療24 h后處死小鼠。

1.2.2AO生產(chǎn)和鑒定 從海帶褐藻中提取海藻酸鈉，制得AO：首先，將枯草芽孢桿菌 ATCC9372在含有0.1%海藻酸鈉、1%蛋白胨、1%酵母提取物、0.2%NaCl、0.2%K2HPO4、0.1%KH2PO4和0.1%MgSO4的150 ml混合培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，37℃，150 r/min，培養(yǎng)3 d。 然后將含有芽孢桿菌的混合培養(yǎng)液加入到海藻酸鹽培養(yǎng)基中(3%海藻酸鈉、1%蛋白胨、1%酵母提取物、0.2%NaCl、0.2%K2HPO4、0.1%KH2PO4、0.1%MgSO4、0.05%CaCl2和0.1%微量元素調(diào)節(jié)pH7.0)，37℃溫育14 d后，通過離心(10 000 r/min，30 min)獲得培養(yǎng)上清液。 使用Amicon過濾器(Millipore，Billerica，MA，USA)分離低于分子量10 kD的AO，最后冷凍干燥，-80℃儲存?zhèn)溆谩⒎肿恿康陀?0 kD的AO分離后，通過HPLC-蘇州島津LC-15C液相色譜儀分析和鑒定。

1.2.3觀察項目及檢測方法

1.2.3.1血清總IgE及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎性細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目測定 末次激發(fā)24 h后處死小鼠，立即摘眼球取血，4℃、4 000 r/min離心15 min獲取血清。用1 ml(分別為0.4、0.3、0.3 ml)PBS液行支氣管肺泡灌洗，回收率均>85%。BALF 4℃、1 500 r/min離心10 min，收集上清。用ELISA法檢測血清中IgE;Kwik-Diff染色法計數(shù)BALF中炎性細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.3.2免疫組織化學(xué)測量CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的表達變化及其特征性分泌形式的表達 用3%過氧化氫的甲醇溶液處理石蠟的組織切片10 min以除去內(nèi)源性過氧化物酶。使用檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L)進行抗原修復(fù)。 將載玻片與正常血清一起孵育以阻斷非特異性結(jié)合，然后使用一抗(稀釋1∶100～1∶200)例如兔抗小鼠CD3多克隆抗體、大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體、大鼠抗小鼠CD8單克隆抗體和大鼠抗小鼠CD68單克隆抗體；大鼠抗小鼠IL-4單克隆抗體、大鼠抗小鼠IL-5單克隆抗體、兔抗小鼠IL-6單克隆抗體、山羊抗小鼠TNF-α多克隆抗體、山羊抗小鼠IL-13多克隆抗體和兔抗小鼠IFN-γ-單克隆抗體。 再滴加二抗(1∶500)共孵育1 h。DAB顯色，DAB的配制①儲備液(DAB 25 mg/ml)的配制：DAB 250 mg+PBS 10 ml，待完全溶解后分裝成1 ml、100 μl、50 μl、20 μl等，-20℃，凍存。②工作液：DAB 儲備液20 μl+PBS 1 000 μl+3% H2O25 μl。

1.2.3.3RT-PCR 測量Th2和Th1相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA的表達水平 小鼠肺組織總RNA提取與定量，參照試劑商所提供的產(chǎn)品說明書進行。PCR擴增：小鼠IL-1β引物可擴增長度為374 bp(F：5′-CTCAGAAGCAGAGCACAAGC-3′，R：5′-CTCAGTG-CAGGCTATGA C CA-3′)；IFN-γ引物可擴增長度為556 bp(F：5′-AATGAACGCTACACACTGCA-3′，R：5′-TGAAGAAGGTAGTAATCAGG-3′)；IL-13引物可擴增長度為638 bp(F：5′-GCCAGGTGTCTTAGCC-AGTC-3′，R：5′-ATGGCCTGGAACTCTGTCTG-3′)；TNF-α引物可擴增長度為286 bp(F：5′-CCACATCTCCCTCCAGAAAA-3′，R：5′-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3′)；IL-4引物可擴增長度為509 bp(F：5′-AATGAACGCTACACACTGCA-3′，R：5′-GTFATGTGGACTTGGACTCA-3′)；IL-5引物可擴增長度為483 bp(F：5′-CCAGCTAGTTGTCATCCTGC-3′，R：5′-TGAAGAAGGTAGTAATCAGG-3′)；IL-6引物可擴增長度為3 586 bp(F：5′-CCAGCTAGTTGTCA-TCCTGC-3′，R：5′-GTFATGTGGACTTGGACTCA-3′)；β-actin引物可擴增片段長度為259 bp(F：5′-GAAATCGTGCGTGACATC-3′，R：5′-GCTTGCTGATCCACATCT-3′)。

2 結(jié)果

2.1小鼠BALF中炎性細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目 哮喘模型的炎性細(xì)胞( 圖1A )和嗜酸性粒細(xì)胞(圖1B)均顯著高于正常組和AO 50 mg/kg和AO 200 mg/kg組(P<0.05)。不同劑量的AO組間炎性細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞均有顯著性差異；AO以劑量依賴的方式顯著抑制OVA誘導(dǎo)哮喘模型的炎性細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的表達。

2.2血清中IgE的表達水平 隨著AO劑量的增加顯著降低OVA誘導(dǎo)的血清中IgE的表達水平(圖2)。模型組血清中的IgE的表達顯著高于正常組和AO(50 mg/kg)組和AO(200 mg/kg)組。并且AO劑量越大，血清中IgE的表達越低。不同劑量的AO組間沒有顯著性降低。

圖1 小鼠BALF中炎性細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞Fig.1 Inflammatory cells and eosinophils in mouse BALFNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200 mg/kg) (P<0.05).

圖2 AO對OVA誘導(dǎo)哮喘模型的血清中IgE表達水平的影響Fig.2 Effect of AO on serum IgE expression in OVA-induced asthmatic modelNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;△.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05).

圖3 AO對Th2和Th1相關(guān)細(xì)胞因子表達的影響Fig.3 Effect of AO on Th2 and Th1 related cytokine expressionNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200 mg/kg) (P<0.05).

圖4 Th2和Th1相關(guān)細(xì)胞因子表達的mRNA的表達水平Fig.4 Expression levels of mRNAs expressed by Th2 and Th1 related cytokinesNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200mg/kg) (P<0.05).

2.3小鼠哮喘模型中Th2和Th1相關(guān)細(xì)胞因子的表達 為了檢查AO對T細(xì)胞調(diào)節(jié)的影響，通過免疫組織化學(xué)測量CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的表達變化。AO抑制CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的表達(圖3)。AO組顯著低于模型組(P<0.05)，不同劑量AO組間差異顯著；隨著AO劑量的增加，AO對CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的抑制程度也顯著增加(P<0.05)。

2.4小鼠哮喘模型中Th2和Th1相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA的表達水平 Th1相關(guān)因子(IL-1β和IFN-γ)和Th2相關(guān)因子(TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6和IL-13)的mRNA的表達( 圖4A )和結(jié)果統(tǒng)計分析(圖4B)，結(jié)果可知AO降低IL-1β和IFN-γ的mRNA水平。 AO處理后Th1和Th2相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA水平呈劑量依賴性抑制，AO顯著抑制IL-5、IL-6和IL-13 mRNA水平的表達。

圖5 Th2和Th1相關(guān)細(xì)胞因子其分泌形式的表達Fig.5 Expression of secreted forms of Th2 and Th1 related cytokinesNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200 mg/kg) (P<0.05).

2.5小鼠哮喘模型中Th2和Th1相關(guān)細(xì)胞因子其分泌形式的表達 哮喘的特征是炎性細(xì)胞分泌增加，Th2和Th1衍生的促炎細(xì)胞因子失衡。通過評估Th1相關(guān)細(xì)胞因子(IFN-γ)和Th2相關(guān)細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-6和IL-13)分泌形式的表達(圖5)可知，在小鼠哮喘模型的肺組織中，Th1和Th2相關(guān)的細(xì)胞因子都過表達。 AO不僅抑制Th2相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5、IL-6和IL-13，還抑制Th1相關(guān)的細(xì)胞因子，如IFN-γ。

3 討論

哮喘發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前越來越多的學(xué)者認(rèn)為氣道的慢性炎癥是哮喘的本質(zhì)，Th1/Th2平衡失調(diào)是氣道炎癥發(fā)生的基礎(chǔ)[6]。疾病的嚴(yán)重程度與浸潤的炎癥細(xì)胞及其細(xì)胞因子的表達有關(guān)。迄今為止，已知與CD4-T細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞有關(guān)的Th2細(xì)胞因子在哮喘的發(fā)展中起主要作用[17]。隨著分子免疫學(xué)與分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，國內(nèi)外對哮喘發(fā)病機制的研究越來越深入，現(xiàn)在免疫療法的概念有了較大的更新與拓展，即將有可能在基因水平上對哮喘開展免疫治療，免疫糾偏基因治療有望成為哮喘研究的一個新的方向[1]。

Th1相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-12和IFN-γ)，Th2相關(guān)細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)，炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達失衡都與哮喘發(fā)作有關(guān)[18]。 其中IL-1是許多炎癥性疾病的重要物質(zhì)，IL-4和IL-13是哮喘的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。 IL-4也可以介導(dǎo)免疫球蛋白(Ig)G轉(zhuǎn)變?yōu)镮gE并募集嗜酸性粒細(xì)胞[19]。 IL-5調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的發(fā)展、活化、遷移和存活，并刺激IL-6的表達。 IL-12調(diào)節(jié)Th1和Th2表達的平衡，它也產(chǎn)生IFN-γ[20]。 IL-13參與B細(xì)胞活化和氣道重塑，導(dǎo)致黏液分泌過多、杯狀細(xì)胞增生、上皮細(xì)胞脫落、基底膜增厚、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤[21]。TNF-α可刺激粒細(xì)胞募集和成纖維細(xì)胞增殖。本研究中哮喘模型組小鼠肺組織中Th2和Th1的促炎癥細(xì)胞尤其Th2細(xì)胞因子表現(xiàn)為異常增多，完全符合上述機制。我們證明AO可以減少小鼠肺泡清洗液中總炎性細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量以及血清中IgE的表達水平。AO顯著抑制CD4和CD68的表達。哮喘相關(guān)細(xì)胞因子 L-13，IL-4和IL-5的mRNA表達水平幾乎完全被抑制。AO不僅下調(diào)Th1/2細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄因子(如T-bet和GATA-3)的表達水平，而且下調(diào)Th1/2細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13等。本研究中，AO以劑量依賴的方式降低IL-13的 mRNA表達水平，200 mg/(kg·d)的AO可以完全阻斷IL-5和IL-6 的mRNA表達。 此外，AO劑量依賴性地抑制IL-5和IL-13的表達。 幾項研究報道，哮喘患者肺泡清洗液中 IFN-γ水平升高，乙酰膽堿誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性在IFN-γ轉(zhuǎn)基因小鼠中比正常小鼠中更為嚴(yán)重[22]。本研究發(fā)現(xiàn)AO可降低OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中IFN-γ水平和Th2相關(guān)細(xì)胞因子的表達。

盡管類固醇已被用作抗哮喘藥物，但由于其相關(guān)的副作用已迫使研究人員尋找更有效的候選藥物[23]。細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)哮喘發(fā)作，積極調(diào)節(jié)這些細(xì)胞因子的化合物可能具有潛在的治療益處。但是哮喘模型的動物實驗結(jié)果能否在臨床取得相同的預(yù)期甚至更好的療效還有待于進一步的研究和探索。這項研究的結(jié)果表明，由于其抑制各種類型的細(xì)胞因子的能力，AO可能顯示出作為抗哮喘藥物候選物的希望。