miR-148b基因?qū)Ω咛钦T導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡及免疫抑制因子的影響研究

湯夏蓮 陳 平 唐義平 張 敏 曹曉紅

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院老年內(nèi)分泌科,成都 610072)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是常見的一種糖尿病微血管并發(fā)癥，高血糖引起的腎小球系膜細(xì)胞的凋亡在DN發(fā)病過程中有重要作用，也是DN腎損傷的主要機(jī)制[1]。miRNA(microRNA)是一類單鏈的小分子RNA，約由19～25個核苷酸組成，不編碼蛋白，在個體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化及腫瘤形成等過程中發(fā)揮重要作用[2]。目前已發(fā)現(xiàn)多個miRNA影響DN的發(fā)生及發(fā)展，且腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞等的功能及結(jié)構(gòu)也受到miRNA的調(diào)節(jié)[3,4]。miR-148b是miRNA大家族中的一員，目前關(guān)于miR-148b在DN中的研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)，mTORC1的異常激活可通過抑制miR-148b-3p引起腎小球上皮細(xì)胞損傷或凋亡[5]；miR-148b的異常表達(dá)可促進(jìn)IgA腎病IgA1的異常糖基化[6]，這提示miR-148b可能在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究旨在觀察抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡及免疫抑制因子TGF-β1表達(dá)的影響，并進(jìn)一步研究對其影響的可能分子機(jī)制，以期為DN的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 低糖、高糖培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco；miR-148b scramble和miR-148b inhibitor由廣州瑞博生物科技有限公司設(shè)計并合成；CCK8試劑購自日本同仁研究所；RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基；TGF-β1、p-IκBα、cyclinD1、Bax抗體購自美國Abcam；Lowry蛋白定量試劑盒購自上海生工；實時熒光定量PCR儀購自美國ABI；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad；流式細(xì)胞儀購自美國BD。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞及培養(yǎng) 小鼠腎小球系膜細(xì)胞(MMCs)購自美國菌種保藏中心(Manassas，VA)。復(fù)蘇凍存在液氮罐中的MMCs細(xì)胞，復(fù)蘇后的細(xì)胞在DMEM-F12培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清及青鏈霉素雙抗)中，置于5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)，每天換液1次，細(xì)胞達(dá)80%左右生長融合時消化傳代。實驗為生長至對數(shù)期的細(xì)胞。

1.2.2實驗分組及轉(zhuǎn)染 分組：①低糖+miR-148b scramble組(LG組，5.6 mmol/L的葡萄糖處理細(xì)胞后瞬時轉(zhuǎn)染miR-148b scramble)；②高糖+miR-148b scramble組(HG組，30 mmol/L的葡萄糖處理細(xì)胞后瞬時轉(zhuǎn)染miR-148b scramble)；③高糖+miR-148b inhibitor組(HG+miR-148b inhibitor組，30 mmol/L的葡萄糖處理細(xì)胞后瞬時轉(zhuǎn)染miR-148b inhibitor)。其中miR-148b scramble和miR-148b inhibitor的轉(zhuǎn)染參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d以每孔3.6×105個細(xì)胞接種細(xì)胞于6孔板，細(xì)胞達(dá)80%～90%生長融合率時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染后48 h的三組細(xì)胞用于后續(xù)實驗研究。

1.2.3各組細(xì)胞miR-148b的表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。利用Trizol法提取轉(zhuǎn)染后48 h的三組細(xì)胞的總RNA，用Oligo6.0軟件設(shè)計目的基因miR-148b及內(nèi)參基因U6引物。參照試劑盒說明設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。

1.2.4細(xì)胞活力檢測 采用CCK8法。以每孔5 000個細(xì)胞接種轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞于96孔板，每組設(shè)置5個重復(fù)孔，收集按照上述分組處理后的細(xì)胞，在每個細(xì)胞孔中加入CCK8試劑10 μl，酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度值(OD值)，波長為570 nm。實驗重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞凋亡率檢測 以每孔1×106個細(xì)胞接種三組細(xì)胞于96孔板，培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌細(xì)胞，Binding緩沖液500 μl懸浮細(xì)胞，分別加入FITC標(biāo)記的Annexin V及PI各5 μl，輕柔混勻，室溫避光染色10～15 min，上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測三組細(xì)胞的凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.2.6TGF-β1、p-IκBα、cyclinD1、Bax蛋白表達(dá)檢測 在轉(zhuǎn)染48 h的三組細(xì)胞中加入適量的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Lowry法測定蛋白濃度，每孔道上樣等量蛋白(40 μg)行SDS-PAGE，電泳后切掉多余的凝膠，電轉(zhuǎn)移目的凝膠至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉膜1 h，4℃搖床孵育1∶1 000稀釋的TGF-β1、p-IκBα、cyclinD1、Bax抗體過液，洗膜，加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，洗膜，ECL試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。以GAPDH作為內(nèi)參基因，計算TGF-β1、p-IκBα、cyclinD1、Bax蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞中miR-148b的表達(dá) 各組細(xì)胞中miR-148b的mRNA表達(dá)結(jié)果如表1所示，HG組miR-148b的mRNA表達(dá)顯著高于LG組(P<0.05)，而HG+miR-148b inhibitor組miR-148b的mRNA表達(dá)顯著低于HG組(P<0.05)。

2.2抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs活力的影響 通過CCK8法檢測各組細(xì)胞活力，結(jié)果如表2所示，HG組細(xì)胞活力顯著高于LG組(P<0.05)，而HG+miR-148b inhibitor組細(xì)胞活力顯著低于HG組(P<0.05)。

2.3抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs凋亡的影響 通過FITC標(biāo)記的Annexin V 及PI雙染法，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖1和表3所示，HG組細(xì)胞凋亡率顯著高于LG組(P<0.05)，而HG+miR-148b inhibitor組細(xì)胞凋亡率顯著低于HG組(P<0.05)。

2.4抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs免疫抑制因子TGF-β1表達(dá)的影響 通過Western blot檢測各組細(xì)胞中免疫抑制因子TGF-β1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2和表4所示，HG組細(xì)胞TGF-β1的蛋白表達(dá)顯著高于LG組(P<0.05)，而HG+miR-148b inhibitor組TGF-β1的蛋白表達(dá)顯著低于HG組(P<0.05)。

表1各組細(xì)胞中miR-148b的表達(dá)

Tab.1ExpressionofmiR-148bincellsofeachgroup

GroupsmRNA expression of miR-148bLG group1HG group7.183±0.6651)HG+miR-148b inhibitor group2.526±0.2782)

Note：Compared with LG group,1)P<0.05;compared with HG group,2)P<0.05.

表2抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs活力的影響

Tab.2EffectofinhibitingmiR-148bexpressiononMMCsactivityinducedbyhighglucose

GroupsODLG group0.772±0.072HG group1.269±0.1121)HG+miR-148b inhibitor group0.987±0.1032)

Note：Compared with LG group,1)P<0.05;compared with HG group,2)P<0.05.

圖1 抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs凋亡的影響Fig.1 Effect of inhibiting miR-148b expression on MMCs apoptosis induced by high glucose

2.5抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs中NF-κB信號通路的影響 通過Western blot檢測各組細(xì)胞中NF-κB信號通路p-IκBα及下游相關(guān)基因cyclinD1和Bax的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3和表5所示，HG組細(xì)胞p-IκBα、cyclinD1和Bax的蛋白表達(dá)均顯著高于LG組(P<0.05)，而HG+miR-148b inhibitor組p-IκBα、cyclinD1和Bax的蛋白表達(dá)均顯著低于HG組(P<0.05)。

表3抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs凋亡的影響

Tab.3EffectofinhibitingmiR-148bexpressiononMMCsapoptosisinducedbyhighglucose

GroupsApoptosis rate(%)LG group2.06±0.27HG group13.47±1.211)HG+miR-148b inhibitor group5.18±0.572)

Note：Compared with LG group,1)P<0.05;compared with HG group,2)P<0.05.

圖2 抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs免疫抑制因子TGF-β1表達(dá)的影響Fig.2 Effect of inhibiting miR-148b expression on expression of TGF-β1 in MMCs induced by high glucose

表4抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs免疫抑制因子TGF-β1表達(dá)的影響

Tab.4EffectofinhibitingmiR-148bexpressiononMMCsonexpressionofTGF-β1inMMCs

GroupsRelative expression of TGF-β1 proteinLG group0.051±0.008HG group0.487±0.0561)HG+miR-148b inhibitor group0.122±0.0152)

Note：Compared with LG group,1)P<0.05;compared with HG group,2)P<0.05.

圖3 抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs中NF-κB信號通路的影響Fig.3 Effect of inhibiting miR-148b expression on NF-κB signaling pathway in MMCs induced by high glucose

表5抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MMCs中NF-κB信號通路的影響

Tab.5EffectofinhibitingmiR-148bexpressiononNF-κBsignalingpathwayinMMCsinduced

Groupsp-IκBαcyclinD1BaxLG group0.046±0.0070.116±0.0130.131±0.016HG group0.227±0.0261)0.421±0.0151)0.734±0.0781)HG+miR-148binhibitor group0.144±0.0162)0.234±0.0272)0.292±0.0352)

Note：Compared with LG group,1)P<0.05;compared with HG group,2)P<0.05.

3 討論

DN是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，病變涉及到包含腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞，最終可發(fā)展為腎小管間質(zhì)纖維化及腎小球的硬化[7,8]。以往研究表明，高糖引起的系膜細(xì)胞缺失和凋亡是導(dǎo)致糖尿病發(fā)生腎損傷的一個主要機(jī)制[9,10]，因此，探討高糖對腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)特性的影響對于DN早期防治和機(jī)制研究具有重要意義。miRNA在動植物體內(nèi)有廣泛存在，可通過降解或抑制靶基因的mRNA表達(dá)而影響生物體的病理及生理過程，多項研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可作為診斷DN發(fā)生及發(fā)展的一個生物標(biāo)記物[11]，但仍需發(fā)現(xiàn)更多有效的用于DN診療的分子靶點(diǎn)。miR-148包含miR-148a和miR-148b，不僅可影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]，在腎病和糖尿病中也發(fā)揮重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，mTORC1的異常激活可通過抑制miR-148b-3p引起腎小球上皮細(xì)胞損傷或凋亡[5]；miR-148b的異常表達(dá)可促進(jìn)IgA腎病IgA1的異常糖基化[6]。關(guān)于miR-148對腎小球系膜細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制研究尚未清楚。

本研究旨在觀察抑制miR-148b表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡及免疫抑制因子TGF-β1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，高糖可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖和凋亡，上調(diào)TGF-β1表達(dá)，而抑制miR-148b表達(dá)后可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。NF-κB是一個核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)炎癥、免疫等過程，多個影響腎臟疾病進(jìn)展的因子均有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，可增加腎小球毛細(xì)血管的損傷[13,14]。有研究發(fā)現(xiàn)，DN患者呈現(xiàn)出更大的與NF-κB結(jié)合活性，其結(jié)合活性的程度與DN的嚴(yán)重程度有密切關(guān)系[15]。而抑制NF-κB信號通路可降低DN中TGF-β1、cyclinD1和Bax的表達(dá)[16,17]。TGF-β1是一個免疫抑制因子，可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖[18]。cyclinD1是一個細(xì)胞周期蛋白，Bax是Bcl-2家族成員之一，發(fā)揮促凋亡作用，DN可通過調(diào)節(jié)cyclinD1和Bax的表達(dá)影響腎小球系膜細(xì)胞的增殖和凋亡[19,20]。本研究結(jié)果顯示，高糖可上調(diào)NF-κB信號通路p-IκBα及下游相關(guān)基因cyclinD1和Bax的蛋白表達(dá)，抑制miR-148b表達(dá)后可降低p-IκBα、cyclinD1和Bax的表達(dá)。這提示抑制miR-148b表達(dá)可通過下調(diào)NF-κB信號通路影響DN的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，抑制腎小球系膜細(xì)胞miR-148b基因表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞活力、凋亡率及免疫抑制因子TGF-β1表達(dá)的增加，機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB信號通路有關(guān)。該研究提示miR-148b可能是DN診療的一個新靶點(diǎn)，但還需更多研究及臨床實踐支持。