百合鱗莖腐爛病病原菌的鑒定及生物學特性研究

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(1.聊城大學 農學院，山東 聊城 252059； 2.中國農業大學 園藝學院/花卉發育與品質調控北京市重點實驗室，北京 100193)

百合為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium) 球根花卉，其花姿雅致、花色豐富、馨香宜人，在我國被廣泛栽培用作切花、盆花和庭院用花等[1]。此外，百合還具有較高的藥用與食用價值[2-3]。由鐮刀菌引起的百合鱗莖腐爛病(又稱根腐病、枯萎病)是百合的主要病害，病原菌主要從肉質根或鱗莖盤基部的傷口侵入，造成肉質根和盤基變褐腐爛，并逐漸向上發展，鱗片出現褐色凹陷病斑，后期鱗片從盤基脫落。染病植株地上部分明顯矮化，葉片自下而上黃化干枯，最后全株枯萎死亡[4]。

近年來，北京市昌平區溫室栽培的百合出現大面積的鱗莖腐爛病，嚴重影響了種球、切花的產量和質量，制約百合周年生產。為確定該地區百合鱗莖腐爛病的病原菌，采集了東方百合雜種系索邦的鱗莖腐爛病病株，對病原物進行分離和鑒定,并分析了主要致病菌的生物學特性，為深入研究該病的發病規律和防治技術奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采樣地點為北京市昌平區李村百合生產合作社，寄主為東方百合雜種系(Liliumoriental hybrids)索邦(Sorbonne)，采集病株具有典型鱗莖腐爛病癥狀。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用組織分離法，用清水沖洗具有典型鱗莖腐爛病癥狀的鱗莖片，于超凈工作臺內切取病健組織交界處，剪成2 mm ×3 mm大小，用75%乙醇浸泡30 s，無菌水漂洗 3次，再于7.5%的次氯酸鈉中浸泡3 min，無菌水沖洗3次，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上25 ℃恒溫培養3～5 d，觀察分離結果，純化后保存菌種待鑒定。

1.2.2 病原菌致病性測定 離體測定：將分離純化的菌株在PDA上培養7 d后，用打孔器制成直徑5 mm的菌餅備用。選取索邦健康鱗莖片，用75%乙醇進行表面消毒，無菌水沖洗。用滅菌解剖針在鱗莖片上刺孔，將菌餅貼在孔上，以貼PDA培養基為對照。保濕培養，每天觀察發病情況。

活體測定：將索邦種球消毒后栽種在直徑12 cm的花盆中，基質為經過高溫滅菌的細河砂。拌入PDA上培養7 d的分離菌，1盆1皿，以拌入PDA培養基為對照。25 ℃培養，及時觀察發病狀況。

根據柯赫氏法則[5]，對接種發病的百合鱗莖片再次進行病原菌的分離與鑒定。

1.2.3 病原菌鑒定 形態鑒定：將分離純化的病原菌分別在PDA上25 ℃恒溫培養，觀察菌落特征。同時用水作為浮載劑，用BX51奧林帕斯顯微鏡觀察菌絲和孢子形態，拍照。

分子生物學鑒定：使用Omega Bio-Tek公司的D3390-02 Fungal DNA Kit提取病原菌基因組DNA。采用真菌核糖體基因內轉錄間隔區(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行rDNA-ITS序列擴增[6]。PCR反應程序：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，54.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將500 bp左右的條帶切膠回收，連接pMD18-T載體并轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，經Amp抗性篩選和菌落PCR檢測后，將含有目的基因片段的陽性克隆送上海鉑尚生物技術有限公司測序。所得序列在NCBI網站用BLAST進行比對分析，利用MEGA 5.0構建系統發育樹。

1.2.4 病原菌生物學特性分析 將直徑7 mm的尖孢鐮刀菌菌塊接種于供試培養基平板(直徑9 cm)中央，置于培養箱中培養，研究培養基種類、溫度、光照、pH值、碳源、氮源對病原菌菌絲生長和產孢量的影響。

培養基的影響：供試培養基分別為PDA、改良沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基(mSDA)、查氏培養基(CZA)、基礎培養基(BM)等4種固體培養基。

溫度的影響：培養溫度分別為5、10、15、20、25、30、35、40 ℃。

光照的影響：設置全光照、光暗交替(12 h光照/12 h黑暗)、全黑暗3個處理。

pH值的影響：pH值梯度設置為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。

2.自主研發模塊化注入工藝。以實用、高效、綠色、環保為目標，開展三次采油注入工藝模塊化、標準化研究。創建了采出水處理、分散溶解、在線熟化、喂入、輔劑加入、注入、配電、儲存稀釋8個模塊單元，具有工廠化預制、橇裝化安裝、可重復利用的特點。施工現場只需要進行橇塊間管道、配電快速連接，大幅度縮短了配注系統流程，提高了效率，降低了成本，提升了信息化管理水平。與常規固定式建站模式相比，設計時間縮短至1 個月，縮短了80%的時間；占地面積減少65%，地面配套設施減少25%，建設周期縮短一半，建設投資減少32%。通過驅油體系研發和注入工藝研發，為現場規模推廣三次采油提高采收率奠定了基礎。

碳源的影響：以查氏固體培養基為基礎培養基，將葡萄糖分別用等量的蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、海藻糖、阿拉伯糖、可溶性淀粉、微晶纖維素代替，制成不同碳源的培養基，以無碳源培養基為對照。

氮源的影響：以查氏固體培養基為基礎培養基，將天門冬酰胺分別用等量的硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母浸膏、尿素、甘氨酸、硝酸鈉代替，制成不同氮源的培養基，以無氮源培養基為對照。

試驗中若無特殊說明，培養條件均為：PDA培養基、25 ℃、12 h光照/12 h黑暗。每個處理3皿，重復3次。培養5 d后采用十字交叉法測量菌落的直徑，6 d后采用血球計數板法測量孢子量。

1.3 數據處理

利用Excel 2007和SPSS 18軟件分析、處理數據。

2 結果與分析

2.1 百合鱗莖腐爛病病原菌的分離與鑒定

2.1.1 病原菌形態及分子生物學鑒定 從索邦鱗莖腐爛病斑上分離純化得到15個菌株(編號為BH1—BH15)，其培養性狀和形態特征為：在PDA培養基上25 ℃恒溫培養，菌落圓形，氣生菌絲絨毛狀或絮狀，易產生色素，顏色多樣；菌絲有隔，分生孢子梗無色，有少量分枝；小型分生孢子無色，形態多樣，多為單細胞，少數為1～3分隔；大型分生孢子無色，鐮刀形，3～10分隔。根據培養性狀和菌絲、孢子形態，初步鑒定15個分離菌株均為鐮刀菌(Fusarium)。

對15個分離株進行rDNA-ITS 測序，分離株BH15的序列長度為564 bp，與序列號為KR364579、MG183708、MH569611、KM268689等腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)的同源性為99%。其余分離株的序列一致，長度均為544 bp，與序列號為MG836253、MH512964、MG020429、KX786247等尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的同源性為100%。根據BH1和BH15的ITS序列構建的系統發育樹如圖1。

圖1 菌株BH1和BH15基于ITS 序列同源性構建的系統發育樹

菌株BH1(尖孢鐮刀菌)在25 ℃的PDA培養基上，單菌落圓形，氣生菌絲羊毛狀，白色，菌落有淺紫色輪紋(圖2A、B)，培養4 d的菌落直徑為5.0～5.1 cm。菌絲有隔，分生孢子梗無色，有少量分枝，分枝呈銳角狀，菌絲內可見許多圓形內容物(圖2C)。小型分生孢子無色，單細胞，橢圓形、卵圓形、柱形等，中央寬，兩端漸窄；大型分生孢子無色，鐮刀形，細長，0～5個隔膜，多數為3隔(圖2D)。菌株BH15(腐皮鐮刀菌)在25 ℃的PDA培養基上，單菌落圓形，氣生菌絲棉絮狀，白色、淺粉色，培養基背面中央紫紅色(圖2E、F)。與BH1相比，菌株BH15生長較慢，培養4 d菌落直徑為4.3～4.4 cm；產孢細胞為簡單瓶梗，瓶梗較短(圖2G)；分生孢子比較粗壯，小型分生孢子較大，大型分生孢子多，馬特型，較胖，兩端較鈍(圖2H)。

A、B：菌株BH1正面、背面； C、D：菌株BH1菌絲、分生孢子形態； E、F：菌株BH15正面、背面； G、H：菌株BH15菌絲、分生孢子形態圖2 菌株BH1和BH15的培養性狀與形態特征

A：離體接種鱗莖片病癥； B：活體接種地上部分病癥； C：活體接種鱗莖病癥圖3 百合接種BH15和BH1后病癥

離體接種時，BH15菌株接種4 d左右開始出現病癥，鱗片腐爛程度強，BH1菌株8 d才出現病癥，鱗片腐爛程度弱；活體接種時，BH15菌株接種15 d開始顯癥，植株地上部發病嚴重而死亡，BH1菌株接種20 d顯癥，地上部表現脫葉、矮小，但不死亡。因此，BH15菌株的致病性較強。

從發病組織上再次分離純化病原菌，其在PDA培養基上的培養性狀及菌絲、孢子特征均與接種前對應的菌株一致。根據柯赫氏法則，百合鱗莖腐爛病的病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)。

2.2 百合鱗莖腐爛病病原菌尖孢鐮刀菌的生物學特性

2.2.1 培養基對尖孢鐮刀菌菌絲生長和產孢量的影響 不同培養基對尖孢鐮刀菌的菌絲生長和產孢量有顯著影響(表1)。培養至第5 天，該菌在BM培養基上的菌落直徑最大，為63.27 mm，但菌絲稀疏，在PDA培養基上的菌落直徑次之，為56.33 mm，菌落致密。PDA培養基上的孢子量最大，為10.00×107個/皿，其次為CZA培養基，BM和mSDA培養基的產孢量較低。綜上，PDA培養基為尖孢鐮刀菌的適宜培養基。

表1 不同培養基上尖孢鐮刀菌菌落的生長情況和孢子量

注：同列不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2.2 溫度對尖孢鐮刀菌菌絲生長和產孢量的影響 不同溫度對菌絲生長量和產孢量的影響顯著(表2)。溫度過低(5 ℃)或過高(40 ℃)時，菌絲停止生長和產孢。該菌在10～35 ℃條件下均可生長，25 ℃時生長最快，其次為30 ℃。25 ℃條件下的產孢量最大，為9.88×107個/皿，其次為30 ℃時，二者無顯著差異。因此，尖孢鐮刀菌生長和產孢的適宜溫度為25～30 ℃，最適溫度為25 ℃。

表2 不同溫度下尖孢鐮刀菌菌落的生長情況和孢子量

2.2.3 光照對尖孢鐮刀菌菌絲生長和產孢量的影響 從表3可以看出，尖孢鐮刀菌在全光照、光暗交替和全黑暗條件下均能較好生長。光暗交替條件下菌絲生長最快，與全黑暗處理相比，菌落直徑差異不顯著，但顯著高于全光照處理。光暗交替條件下的產孢量最高，達9.75×107個/皿，顯著高于全光照和全黑暗環境。

表3 不同光照下尖孢鐮刀菌菌落的生長情況和孢子量

2.2.4 pH值對尖孢鐮刀菌菌絲生長和產孢量的影響 從表4可以看出，尖孢鐮刀菌在pH值4～12內均可生長，在pH值為5及堿性的環境條件下生長較快，但在高pH值(10～12)下菌絲疏松。培養基的酸堿度影響色素的形成，pH值5～8時，該菌易產生紅色色素。pH值為3時不產孢，在pH值4～12內，產孢量先增加后降低，當pH值為7時，產孢量最大，達7.70×107個/皿。

表4 不同pH值下尖孢鐮刀菌菌落的生長情況和孢子量

2.2.5 碳源對尖孢鐮刀菌菌絲生長和產孢量的影響 尖孢鐮刀菌在有糖和無糖培養基上均能生長(表5)。最適宜菌絲生長的碳源為乳糖，5 d時菌落直徑可達60.33 mm，其次為麥芽糖、葡萄糖，與對照(無碳)相比，海藻糖和可溶性淀粉抑制了菌絲的生長。該菌在以葡萄糖和海藻糖為碳源的培養基上產孢量較多，分別是對照的5.50倍和5.33倍。

表5 不同碳源下尖孢鐮刀菌菌落的生長情況和孢子量

2.2.6 氮源對尖孢鐮刀菌菌絲生長和產孢量的影響 雖然尖孢鐮刀菌在無氮培養基上也可生長，但菌絲非常稀疏、不產孢，說明尖孢鐮刀菌對氮素的要求較高(表6)。菌絲生長氮源以硝酸鈉和酵母浸膏最好，硫酸銨和氯化銨最差，表明該菌對硝態氮和有機氮的利用效果較好，對銨態氮的利用效果較差。氮源也影響其色素的產生，蛋白胨和酵母浸膏有利于產生紅色色素。以甘氨酸為氮源時，病原菌的產孢量最高，達3.93×107個/皿，顯著高于其他處理，其次是酵母浸膏、蛋白胨和尿素，而在無氮與銨態氮條件下均不產生分生孢子，表明有機氮有利于尖孢鐮刀菌產孢。

表6 不同氮源下尖孢鐮刀菌菌落的生長情況和孢子量

3 結論與討論

在生長期或貯藏期，百合較易發生鱗莖腐爛病。引起貯藏期鱗莖腐爛的病原真菌主要有圓孤青霉(Penicilliumcyclopium)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、黑曲霉(Aspergillusniger)、叢花青霉(Penicilliumcorymbiferum)和尖孢鐮刀菌等[7]。生長期鱗莖腐爛病的病原菌主要有尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、串珠鐮刀菌(FusariummoniliformeSheldon)和層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)等[8]。研究表明，不同地區百合生長期鱗莖腐爛病的病原菌不完全相同。甘肅省臨洮縣蘭州百合枯萎病病原菌經分離，被鑒定為尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)和禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)[9]。湖南省隆回縣龍牙百合生長期鱗莖腐爛病和云南省嵩明縣觀賞百合根腐病的病原菌均為尖孢鐮刀菌[10,4]。引起甘肅省會川縣觀賞百合根腐病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌[11]。雖然不同地區的病原菌不完全相同，但主要致病菌均為尖孢鐮刀菌，僅嚴重侵染百合的為百合專化型(F.oxysporumf.sp.lilii)，對百合和唐菖蒲都致病的為唐菖蒲專化型(F.oxysporumf.sp.gladioli)[12-13]。本研究鑒定北京昌平地區東方百合雜種系索邦鱗莖腐爛病病原菌為尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌。從分離數量上，尖孢鐮刀菌占優勢，占總分離株的93.3%；從致病性上，腐皮鐮刀菌在顯癥時間和致病程度上都強于尖孢鐮刀菌。尖孢鐮刀菌也能引起該地區食用百合鱗莖腐爛[14]，但與該研究結果相比，本研究還鑒定了腐皮鐮刀菌為致病菌。

百合鱗莖腐爛病是土傳病害，病原菌主要以菌絲體在鱗莖內或以菌絲體、厚垣孢子及菌核隨病殘體在土壤中越夏越冬，成為次年百合發病的初侵染源。高溫高濕、排水不良、氮肥施用過多、通風不暢、土壤偏酸、連作等均有利于該病發生[15]。本研究的病樣采集自昌平郊區的溫室觀賞百合生產基地，由于多年連作，病害逐年加重。為利于病害的流行預測和防治，進一步研究了主要致病菌尖孢鐮刀菌的生物學特性。該菌生長和產孢的最適培養基為PDA培養基；生長和產孢的適宜溫度為25～30 ℃，最適溫度為25 ℃；菌絲生長的最適pH值為5，產孢的最適pH值為7；菌絲在12∶12光暗交替條件下生長最快，產孢量最高；對多種不同碳源均能利用，菌絲生長的最適碳源為乳糖，產孢的最適碳源為葡萄糖；對有機氮和硝態氮利用較好，菌絲生長的最適氮源是硝酸鈉和酵母浸膏，產孢的最適氮源是甘氨酸。本研究僅選擇了4種培養基，有一定的局限性，應進一步篩選其他培養基，如增加百合培養基、百合葡萄糖培養基等專用培養基[7]。本研究中，適宜病原菌菌絲生長的溫度和pH值范圍與紅景天根腐病菌基本相同[16]。光暗交替有利于尖孢鐮刀菌菌絲生長，這與王中武等[17]對尖孢鐮刀菌的研究結果一致，但尖孢鐮刀菌亞麻專化型在持續黑暗環境下生長最好[18]。地域或寄主不同，尖孢鐮刀菌對碳源、氮源的利用情況有差異。尖孢鐮刀菌亞麻專化型生長與產孢的最適氮源為氯化銨[18]，而本試驗的結果表明，銨態氮顯著抑制了尖孢鐮刀菌的菌絲生長與產孢。硝態氮有利于蘭州百合枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌的生長和產孢，與本試驗的結果相近，但其生長和產孢的最適碳源為蔗糖[19]，與本試驗的結果不同。在生產實際中，可通過改變栽培環境、合理施肥、合理輪作等方式來抑制病原菌的生長與產孢，從而減輕百合鱗莖腐爛病的發生。