有髯鳶尾種質離體保存研究

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(1.河北省林業科學研究院，河北 石家莊 050061； 2.河北省林木良種工程技術研究中心，河北 石家莊 050061； 3.天津創世生態景觀建設股份有限公司，天津 300000； 4.河北農業大學，河北 保定 071000)

種質資源又稱遺傳資源，是物種進化、遺傳學研究及植物育種的物質基礎[1]。離體保存法作為植物種質資源圃活體保存替代技術，是保證植物種質資源遺傳多樣性的一種新興途徑[2-3]，可以有效延長組培苗繼代周期，避免頻繁繼代，節約培養成本，并且使材料一直處于生長狀態，保持種質優良特性。相關研究[4-7]表明，甘露醇、山梨醇等高滲保透劑以及CCC、ABA、PP333等植物生長延緩劑可以有效抑制植物組培苗的高生長，使組培苗節間縮短，并矮化、壯化植株，已經在南天竹[8]、馬鈴薯[5]、茶樹[9]等植物的研究上取得了較有價值的研究成果。

有髯鳶尾(BeardedIris)，為鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(Iris)多年生草本植物，是垂瓣上有髯毛附屬物的鳶尾品種的統稱[10-11]。目前，全世界有髯鳶尾已超過2萬余種[12]，花色包括了除正紅色以外所有的顏色，有髯鳶尾不同的花色組合不僅可以美化、香化環境，還能形成良好的園林綠化景觀。在現階段，有髯鳶尾種質資源主要依靠活體保存[13]，而活體保存需要現代設施條件，保存成本較高，且易受病蟲害等的影響而造成珍貴品種資源的流失。此外，在生產過程中，有髯鳶尾組織培養誘導成苗需4～6個月的時間[14-16]，且外植體花蕾的采集受花期限制，不可避免出現頻繁繼代培養，造成人力物力浪費以及可能發生變異等問題。因此，為克服傳統活體保存方法的缺點，解決組織培養產業化生產中出現的問題，開展有髯鳶尾種質資源離體保存研究迫在眉睫。鑒于此，選用PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇6種藥劑，對有髯鳶尾的離體保存方法進行了初步研究，以期為有髯鳶尾的種質離體保存優化、組培產業化以及種質創新提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選擇穩定、正常生長的有髯鳶尾1A(印度首領×白與藍)繼代5次組培苗為試驗材料，在河北省林業科學研究院組培實驗室進行有髯鳶尾種質離體保存研究。

1.2 試驗方法

采用單因素試驗設計，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA為基本培養基，分別添加不同質量濃度的PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇，每種藥劑的質量濃度梯度見表1。對照(CK)不添加藥劑。培養基中瓊脂為6.5 g/L，蔗糖為30.0 g/L，pH值為5.8～6.0，采用塑料封口膜封口，高壓滅菌。滅菌溫度為121 ℃，滅菌時間為18 min。將有髯鳶尾1A組培苗以芽間剝離的方式分成3株/叢，接種到培養基中，每處理接種15瓶，每瓶接種3叢。每處理重復3次。培養室中溫度為23～25 ℃，光照強度為1 000～1 500 lx，光照時數為12 h/d(每日的6：00—18：00為光照時間)。

表1 有髯鳶尾1A組培苗種質離體保存不同藥劑質量濃度設置

注：P、B、C、A、G、S分別代表PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇。

1.3 測定指標與方法

接種完成后，隨時觀察、記錄組培苗的生長狀況。接種120 d時統計存活率、黃葉率、增殖倍數、株高。其中，株高為株叢基部到頂部之間的距離(不包括根莖)。

存活率=存活株數/接種株數×100%；

黃葉率=黃葉株數/接種株數×100%；

增殖倍數=增殖后芽數/起始芽數。

1.4 數據處理

數據用Excel進行表格記錄與數據運算，用DPSv 7.05進行差異顯著性檢驗。用隸屬函數法綜合評價不同處理的離體保存效果，對存活率、黃葉率、增殖倍數、株高的隸屬值進行累加，求取平均值。

X(u)= (X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，X(u)為各指標隸屬函數值累加后求取的平均值。X為某一處理的某一指標的測定值，Xmax為所有處理在該指標中的最大值，Xmin為所有處理在該指標中的最小值。隸屬函數值平均值越大，組培苗生長越好，離體保存效果也越好[17]。

2 結果與分析

2.1 PP333對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表2可以看出，添加不同質量濃度的PP333對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數、株高4個指標部分處理間差異達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，P1—P5處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡。可見，不同質量濃度PP333均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨著PP333質量濃度的增加，株叢黃葉率、株高均呈現明顯下降趨勢，而增殖倍數則表現為先上升后下降的趨勢。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，P4即PP3338.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無黃葉現象，增殖倍數為3.1，株高為6.8 cm。PP333質量濃度過高會對組培苗產生毒害作用。另外，P4處理有少量生根現象，這可能與適宜濃度的PP333能促進鳶尾組培苗的生根生長有關。

表2 不同質量濃度PP333對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

注：不同大、小寫字母表示在0.01、0.05水平差異，下同。

2.2 B9對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表3可以看出，添加不同質量濃度的B9對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數、株高4個指標部分處理間差異分別達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，B1—B5處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡。可見，不同質量濃度B9均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨著B9質量濃度的增加，株叢黃葉率、株高均呈現出明顯下降趨勢，而增殖倍數則是先上升后下降。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，B5即B915.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，黃葉率為50.0%，增殖倍數為2.9，株高為 4.9 cm。

表3 不同質量濃度B9對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

2.3 CCC對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表4可以看出，添加不同濃度的CCC對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數、株高4個指標部分處理間差異分別達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，C1—C5處理組培苗存活率均在75.0%以上，CK組培苗全部死亡。可見，不同質量濃度CCC均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨CCC質量濃度的增加，株叢存活率逐漸升高，黃葉率依次降低，增殖倍數、株高均呈現出先上升后下降的趨勢。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，C5即CCC 40.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無黃葉現象，增殖倍數為3.4，株高為5.8 cm。

表4 不同質量濃度CCC對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

2.4 ABA對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表5可以看出，添加不同質量濃度的ABA對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數、株高4個指標部分處理間差異分別達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，A1—A5處理組培苗存活率均在66.8%以上，CK組培苗全部死亡。可見，不同質量濃度ABA均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨著ABA質量濃度的增加，株叢存活率、增殖倍數、株高均呈現明顯下降趨勢，而株叢黃葉率則表現為先降低后上升的趨勢。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，A3即ABA 4.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為91.8%，黃葉率為13.2%，增殖倍數為2.5，株高為3.4 cm。ABA添加濃度過高，對株叢生長的抑制作用過大，反而會產生毒害作用，嚴重影響株叢的正常生長與增殖。

表5 不同質量濃度ABA對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

2.5 甘露醇對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表6可以看出，添加不同質量濃度的甘露醇對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數、株高4個指標部分處理間差異分別達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，G1—G4處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡。可見，不同質量濃度甘露醇均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨著甘露醇質量濃度的增加，株叢黃葉率、株高均呈現明顯的下降趨勢，而增殖倍數則表現為先上升后下降的趨勢。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，G4即甘露醇40.0 g/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無黃葉現象，增殖倍數為2.9，株高為2.6 cm。

表6 不同質量濃度甘露醇對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

2.6 山梨醇對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表7可以看出，添加不同質量濃度的山梨醇對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數、株高4個指標部分處理間差異分別達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，S1—S4處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡。可見，不同質量濃度山梨醇均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨著山梨醇質量濃度的增加，增殖倍數、株高均呈現明顯的下降趨勢，而株叢黃葉率則表現為先上升后下降的趨勢。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，S3即山梨醇30.0 g/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無黃葉現象，增殖倍數為2.2，株高為4.4 cm。山梨醇添加濃度過高，對株叢生長的抑制作用過大，反而會產生毒害作用，嚴重影響株叢的生長與增殖。

表7 不同質量濃度山梨醇對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

2.7 有髯鳶尾1A組培苗離體保存處理綜合評價

由表1—7可知，存活率、黃葉率、增殖倍數、株高4個指標的最優處理并不相同，因此，對4個指標進行了隸屬函數評價。由綜合評價結果(表8)可知，G4處理的綜合評價值最高，達到81.87；其次是G3處理，綜合評價值為81.66；再次是S3處理，綜合評價值為81.44；P5、C5、P4、C4 4個處理的綜合評價值也均在80以上，組培苗生長狀況均良好。而A5處理綜合評價值最低，僅為37.06，組培苗株叢受害嚴重。綜上可知，有髯鳶尾有髯鳶尾1A組培苗的種質離體保存最佳處理為G4，組培苗接種120 d時，株叢存活率為100%，無黃葉現象，增殖倍數為2.9，株高為2.6 cm。

表8 有髯鳶尾1A組培苗離體保存處理綜合評價

3 結論與討論

常規組織培養條件下，有髯鳶尾的最佳繼代周期約為30 d。當繼代周期>30 d時，會導致株叢出現葉片黃化、腐爛、衰老，乃至死亡，不利于下一代的增殖培養。相關研究表明，甘露醇與山梨醇是同分異構體，屬于惰性物質，不易被外植體吸收，可以提高培養基的滲透壓，抑制植物細胞吸水，延緩植株生長[18]；CCC是一種季銨鹽類植物生長調節劑，具有矮化植株的作用[8]；ABA具有抗赤霉素的作用，降低RNA聚合酶的活性，抑制DNA的合成，從而抑制材料的生長[19]；B9是一種高效低毒的植物生長延緩劑，可抑制莖端下部區域的細胞分裂和伸長生長[5]；PP333是植物生長延緩劑[6]，可抑制赤霉素的生物合成，使植株節間縮短，株型緊湊，矮小健壯。本研究發現，添加不同質量濃度的PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇均能有效抑制有髯鳶尾1A組培苗的生長，株叢保存培養120 d仍生長正常，不需要轉接繼代，極大地延長了繼代周期。可見，使用PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇6種藥劑進行有髯鳶尾的種質離體保存均具有較高的可行性。

利用隸屬函數法進行試驗結果的綜合評價，已經廣泛應用到植物抗性、生理、繁殖等[20-23]研究中，并得到大多數學者和專家的認可。綜合考慮有髯鳶尾1A組培苗培養120 d的抑制效果及株叢生長狀況，PP333、B9、CCC、ABA和甘露醇、山梨醇最適質量濃度分別為8.0、15.0、40.0、4.0 mg/L和40.0、30.0 g/L。本研究條件下，ABA、山梨醇質量濃度過高時，對株叢生長的抑制作用過大，嚴重影響株叢的生長與增殖，表明藥劑添加濃度過高，反而會產生毒害作用。這與在文心蘭[2]、草莓[7]、香果樹[24]、葡萄[25]等植物上的離體保存研究結果相似。

另外，PP3338.0 mg/L處理中組培苗出現少量生根現象，這可能與適宜濃度的PP333能促進鳶尾組培苗的生根生長有關。可見，添加PP333后，組培苗株高被抑制，反而促進了根系的生長，但組培苗生根現象是否會影響種質保存的時間，以及是否會引發植株變異，還需進一步研究。

綜合存活率、黃葉率、增殖倍數、株高及隸屬函數評價結果，有髯鳶尾1A組培苗的種質離體保存最佳處理為G4，即甘露醇40.0 g/L的處理，組培苗接種120 d時，株叢存活率為100%，無黃葉現象，增殖倍數為2.9，株高為2.6 cm。

另外，鳶尾離體種質保存在鳶尾種質資源研究中尚屬首例，本研究僅對有髯鳶尾1A組培苗接種120 d的離體保存效果進行了探索，后續將在更長時間的種質保存與恢復方面進行深入研究。