斜紋夜蛾保幼激素環氧水解酶基因的克隆和原核表達

張麗麗，武怡瓊，楊正飛，郭 麗，魏佳平，闞云超

(1.信陽師范學院 生命科學學院/大別山農業生物資源保護與利用研究院,河南 信陽464000; 2.南陽師范學院/河南省伏牛山昆蟲生物學實驗室,河南 南陽 473061)

斜紋夜蛾(Spodopteralitura)屬鱗翅目夜蛾科，為全球熱帶和亞熱帶主要農業害蟲，國內以華南、華東地區發生為重。斜紋夜蛾以幼蟲咬食葉片及葉柄，是一種間歇性猖獗發生的害蟲[1]。隨著近年溫室效應導致氣候持續變暖以及種植業結構變化、蔬菜種植面積不斷擴大，斜紋夜蛾發生危害逐年加重，已成為農作物重要害蟲之一[2]。

保幼激素(Juvenile hormone,JH)是昆蟲后腦兩側咽側體合成分泌的一種萜烯類化合物[1]。JH在不同齡期昆蟲的血淋巴中通過滴度的變化(合成與代謝)調控昆蟲的生長發育，其代謝通過保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)、保幼激素環氧水解酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)和保幼激素二醇激酶(Juvenile hormone diol kinase,JHDK)3種特異性酶催化完成[3-5]。JHEH屬于mEH家族，與組織中的膜結合，催化血淋巴中JH和保幼激素酸(Juvenile hormone acid,JHa)不可逆地轉化為保幼激素二醇(Juvenile hormone diol,JHd)和保幼激素酸二醇(Juvenile hormone acid diol,JHad)并中斷咽側體JH合成[3]。

JHEH基因首先從煙草天蛾(Manducasexta)中分離得到[6]，之后在鱗翅目昆蟲粉紋夜蛾(Trichoplusiani)[7]、家蠶(Bombyxmori)[8]、谷食夜蛾(Helicoverpazea)[9]、棉鈴蟲(H.armigera)[10]等中分別克隆了JHEH基因，其表達存在差異。粉紋夜蛾和煙草天蛾JHEH基因主要在卵中特異表達[6-7]；谷食夜蛾JHEH基因主要在卵巢中表達[9]；而家蠶的脂肪體、中腸等幾乎所有組織中都有JHEH基因表達[11-12]。Zhou等[13]解析了BmJHEH的晶體結構，該蛋白質是一個典型的α/β水解酶二聚體，N末端的XWG氨基酸結合細胞膜，與亞細胞定位有關。序列分析發現，其功能區氨基酸殘基都非常保守，有一個較深的疏水口袋結合JH，其中2個酪氨酸殘基Tyr298、Tyr373和HGWP花樣結構組成陰氧離子洞，催化三聯體Asp227、Glu403、His430氨基酸殘基高度保守。半翅目綠盲蝽(Apolyguslucorum)JHEH蛋白結構的模擬結果顯示，其存在與家蠶相似的功能結構域，RNAi干擾JHEH基因表達導致綠盲蝽幼蟲存活率明顯下降，且部分幼蟲蛻皮困難，甚至死亡無法延續下一代[14]。半翅目褐飛虱(Nilaparvatalugens)JHEH基因的表達下調對幼蟲存活率影響較小，但是顯著增加長翅型褐飛虱種群中短翅個體數量，達到總量的50%以上，且以雌性為主[15]。

本研究對斜紋夜蛾JHEH基因(SlJHEH)進行克隆和生物信息學分析，并通過原核表達系統高效表達SlJHEH蛋白，為研究該蛋白質的體外活性和生物功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

斜紋夜蛾幼蟲來自華南師范大學昆蟲研究所。飼養方法:(1)卵消毒: 在卵孵化前1 d，放入5%的甲醛溶液中消毒15 min，用無菌水漂洗，晾干；(2)幼蟲飼養: 將初孵幼蟲接入塑料培養盒中，待長到3齡時，分盒飼養，直到預蛹期，然后將預蛹幼蟲轉入干凈的飼養盒中化蛹；(3)成蟲產卵: 在蛹羽化前2 d，區分雌、雄蛹，將蛹按雌雄配對，置于單獨的培養盒中羽化，蛹羽化后，用15%的蜂蜜飼養，以利于產卵。飼養條件：溫度25～27 ℃，相對濕度70%～75%，光周期16 h∶8 h (光∶暗)。

RNA提取試劑RNAiso plus、反轉錄酶M-MLV、DL5000 DNA Marker、PCR常用試劑(dNTPs、10×PCR buffer和rTaq)、DNA限制性內切酶、pMD18-T載體、Solution Ⅰ、T4 DNA ligase、10× T4 DNA ligase buffer、Premixed protein marker(low)均購自TaKaRa公司(大連，中國)；原裝進口低熔點BIOWEST瓊脂糖、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、SDS-PAGE和Western blotting相關試劑購自鄭州寶賽生物科技有限公司；Western blotting所用硝酸纖維素膜為英國Whatman公司產品；大腸桿菌(E.coli) DH5α、BL21(DE3) 感受態細胞和原核表達用pET32a 質粒由華南師范大學昆蟲與科學技術研究所馮啟理教授饋贈。

1.2 方法

1.2.1 中腸總RNA提取與cDNA的獲得 選取斜紋夜蛾6齡進食期3 d的幼蟲，按照RNAiso plus說明書提取中腸總RNA后，用Nanodrop紫外分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量，-80 ℃保存備用[16]。按照TaKaRa公司M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit說明書合成第一鏈cDNA，保存于-20 ℃。

1.2.2 引物設計與序列擴增 從NCBI數據庫獲得SlJHEH全長序列(GenBank登錄號：XM_022981795)，設計上游引物：5′-GGATCCATGGCGCGCCTGTTGTTTA-3′(劃線處為BamH Ⅰ 酶切位點)；下游引物：5′-GTCGACTTACAAATCAGTCTTGAC-3′(劃線處為SalⅠ 酶切位點)。引物由安徽通用生物技術有限公司合成。以上述反轉錄獲得cDNA為模板，用特異性引物擴增JHEH目的序列。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32個循環; 72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離并回收。將目的片段與pMD18-T 載體連接，轉化E.coliDH5α，經過0.1 g/L氨芐青霉素(Amp)篩選單克隆，運用PCR和雙酶切鑒定后，送安徽通用生物技術有限公司測序。將重組載體命名為pMD18T-SlJHEH。測序正確的序列用于原核表達載體的構建。

1.2.3 序列分析及系統發育樹構建 運用DNAstar分析開放閱讀框(ORF)、蛋白質分子質量、等電點。在NCBI 數據庫對本研究獲得基因推導的氨基酸序列進行同源性搜索; 使用Clustal W2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)和ESPript (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgibin/ESPript.cgi)進行同源性比較[13]；通過Mega 6.0軟件構建系統發育樹[17]。

1.2.4SlJHEH原核表達載體的構建 運用限制性內切酶BamHⅠ和SalⅠ對pMD18T-SlJHEH和pET32a空載體進行酶切，割膠回收目的片段，經T4連接酶16 ℃過夜連接，轉化E.coliDH5α，經過氨芐青霉素篩選單克隆，運用PCR和雙酶切鑒定，然后送到安徽通用生物技術有限公司測序。將重組載體命名為pET32a-SlJHEH。

1.2.5 SlJHEH重組蛋白的誘導表達 將pET32a-SlJHEH重組質粒轉入BL21(DE3)感受態細胞，獲得的陽性單菌落接種于LB液體培養基(含0.1 g/L Amp)中，37 ℃、200 r/min培養過夜。按1∶50 接種于5 mL 含Amp的LB培養基中繼續培養至OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，然后于28 ℃、200 r/min搖床中培養4 h，收集1.5 mL菌液，于12 000×g下離心10 min以收集細胞沉淀。用200 μL PBS緩沖液(NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.44 g、KH2PO40.24 g,加水至1 L,pH值7.4) 懸浮沉淀，超聲波破碎至液體透明(超聲功率為400 W,工作5 s，間隔5 s,重復一定次數)，于12 000×g離心10 min，分別收集上清和沉淀。以未重組載體pET32a作為對照，所有試驗條件保持一致。

1.2.6 SDS-PAGE蛋白電泳和Western blotting分析 取菌體、上清和沉淀各10 μL，并分別加入10 μL的2×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，冰上放置3 min。采用12% SDS-PAGE凝膠電泳分離15 μL的樣品，以未重組載體pET32a作為對照，處理條件保持一致。蛋白質凝膠用考馬斯亮藍R250染色，最后成像分析。

蛋白質經SDS-PAGE電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜上，用封閉液(含3%牛血清白蛋白)于37 ℃封閉2 h。然后與His標簽抗體(1∶10 000稀釋) 于30 ℃下反應1 h，用洗滌液洗膜3次，每次10 min。與堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG酶標抗體 (Anti-IgG AP conjugate) (1∶2 000稀釋) 于30 ℃下反應1 h，然后用洗滌液洗膜4次，每次5 min。最后用四氮唑蘭(NBT)/5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸鹽(BCIP)進行顯色反應。

2 結果與分析

2.1 斜紋夜蛾中腸RNA的提取

利用RNAiso plus提取斜紋夜蛾6齡進食期3 d中腸的總RNA，Nanodrop紫外分光光度計測得其質量濃度為3 265 ng/μL，A260/A280值為1.942，A260/A230值為2.078。經1%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀下觀察檢測總RNA的質量，結果(圖1)顯示，28S和18S rRNA條帶清晰，提取質量良好，無明顯降解。

圖1 斜紋夜蛾中腸總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 斜紋夜蛾JHEH基因的擴增與分析

利用特異性引物，以cDNA為模板進行RT-PCR，得到SlJHEH基因片段(圖2)。該基因ORF長為1 389 bp，編碼462個氨基酸，預測分子質量為52 ku，等電點為8.68。其中有179個疏水性氨基酸和91個極性氨基酸，經分析該蛋白質可能為可溶性蛋白。

M：DNA分子質量標準； 1：PCR產物圖2 SlJHEH基因的PCR擴增產物

2.3 斜紋夜蛾JHEH氨基酸序列同源性比對及進化樹分析

與其他不同物種的JHEH氨基酸序列同源性比對發現，SlJHEH存在與細胞膜結合的高保守性XWG序列(圖3)，推測與其亞細胞定位有關[13]。Tyr297、Tyr372和HGWP花樣結構氨基酸殘基組成疏水性陰氧離子洞，活性位點催化三聯體Asp226、Glu402和His429氨基酸殘基發揮其水解活性，這2個基本結構是昆蟲或哺乳動物環氧水解酶發揮作用的功能性基序[13-14,18]，在不同物種中高度保守(圖3)。

除SlJHEH外，從上至下分別為Helicoverpa armigera(ACM78602)、Trichoplusia ni(AAB88192)、Bombyx mori(NP_001037201)、Spodoptera exigua(ABD85119)、Drosophila melanogaster(ACV04637、NP_611386、AAM88329)、Aedes aegypti(AAM88326)、Manduca sexta(AAC47018)的JHEH蛋白，氨基酸序列均從NCBI數據庫下載，圖4同；▲標記N端膜結合氨基酸；●標記活性位點催化三聯體的Asp226、Glu402、His429殘基；★標記組成陰氧離子洞的Tyr297、Tyr372殘基和HGWP花樣結構

系統發育樹分析發現，SlJHEH與鱗翅目的棉鈴蟲(ACM78602)、粉紋夜蛾(AAB88192)、家蠶(NP_001037201)、小菜蛾(Spodopteraexigua，ABD85119) 和煙草天蛾(AAC47018)的JHEH蛋白很好地聚在一起，尤其與棉鈴蟲JHEH氨基酸序列同源性高達78%，而與雙翅目果蠅(Drosophilamelanogaster，NP_611386、ACV04637和AAM88329)和埃及伊蚊(Aedesaegypti，AAM88326)的親緣關系較遠(圖4)。

2.4 重組表達載體pET32a-SlJHEH的構建

將構建的重組表達載體pET32a-SlJHEH轉化E.coliDH5α菌株，挑取5個菌落直接作為模板進行PCR擴增，在1 400 bp處均能擴增出單一條帶(圖5A)，隨機挑選其中的單菌落擴大培養后提取質粒進行雙酶切，在1 400 bp處也出現單一條帶(圖5B)，說明JHEH基因已連入pET32a表達載體。經進一步測序驗證，重組表達載體pET32a-SlJHEH構建成功。

圖4 SlJHEH的系統發育樹

2.5 斜紋夜蛾JHEH重組蛋白的誘導表達及Western blotting鑒定

表達產物經SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍R250染色后，pET32a-SlJHEH轉化菌在分子質量接近66 ku處，比空載體pET32a轉化菌多出一條明顯的蛋白質條帶，表達蛋白為目的蛋白(分子質量52 ku)和pET32a標簽(分子質量約18 ku)的融合蛋白,檢測結果與預測的融合蛋白分子質量相符(圖6A)。目的蛋白主要以包涵體形式存在，上清液中有少量可溶性蛋白(圖6A)。采用His標簽抗體進行Western blotting分析，進一步確認該蛋白質為與His標簽融合的目的蛋白(圖6B)。

M：DNA分子質量標準； 1—5：菌落PCR產物； 6：pET32a-SlJHEH質粒酶切前； 7：pET32a-SlJHEH質粒酶切后圖5 重組表達載體pET32a-SlJHEH的PCR(A)和酶切(B)鑒定

M：蛋白質分子質量標準； 1：pET32a誘導表達產物； 2：pET32a-SlJHEH誘導表達產物;3:pET32a-SlJHEH誘導表達產物上清液; 4:pET32a-SlJHEH誘導表達產物沉淀圖6 pET32a-SlJHEH表達產物的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)鑒定

3 結論與討論

昆蟲末齡幼蟲到蛹期的變態依賴保幼激素的快速降解[14]。JHEH作為保幼激素降解代謝中的關鍵酶之一，將JH和JHa降解為JHd和JHad[ 9,19 ]。自從煙草天蛾中克隆出第1個JHEH基因以來[6]，又先后在鱗翅目粉紋夜蛾、家蠶、谷食夜蛾，蚤目貓櫛(Ctenocephalidesfelis)，雙翅目果蠅，直翅目蟋蟀(Gryllusassimilis)，半翅目褐飛虱、綠盲蝽，膜翅目蜜蜂(Apismellifera)，鞘翅目赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)，同翅目棉蚜(Aphisgossypii)等多個目的昆蟲中研究了JHEH基因[7-9,12,14,19-24]。本研究從斜紋夜蛾克隆了JHEH基因的ORF序列，并對其編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析。SlJHEH基因ORF大小為1 389 bp，編碼462個氨基酸。該序列具有明顯的JHEH酶的典型特征，即氨基酸序列中具有保守的天冬氨酸(Asp226)、組氨酸(His429)和谷氨酸(Glu402)組成的活性位點催化三聯體，HGWP結構域和2個酪氨酸殘基(Tyr297和Tyr372)組成其陰氧離子洞，N端有膜結合XWG基序，這些均與家蠶和綠盲蝽JHEH三維結構的研究結果一致[13-14]。

本研究在原核表達系統大腸桿菌中，經過一般誘導表達條件28 ℃誘導4 h，獲得大量的目的融合蛋白，分子質量約為66 ku。目的蛋白主要以包涵體形式存在，但是上清中已有少量可溶性的重組蛋白，說明該蛋白質為可溶性蛋白，這與推測氨基酸序列分析結果一致，可進一步改變誘導條件增加上清中可溶性蛋白的表達量。另外，原核表達系統缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類[25]，表達出來的可溶性蛋白是否具有生物學活性也需要進一步確認。根據pET32a表達載體的特點，用His標簽抗體對誘導表達蛋白進行Western blotting檢測，有相應大小的條帶出現，表明載體按照正確的翻譯框架翻譯并表達出帶有His標簽的目標蛋白。

JH是昆蟲特異的激素，研究JH生物合成和代謝途徑中的重要酶，對發現更有效的保幼激素類似物和建立利用DNA重組技術的新害蟲控制方法有很大幫助。目前，針對煙草天蛾和粉紋夜蛾生物學特性開發的特異性酶抑制劑被認為是潛在的殺蟲劑[26-27]。本研究克隆了斜紋夜蛾保幼激素環氧水解酶的基因,構建了重組表達載體pET32a-SlJHEH，并在E.coliBL21(DE3)表達菌株中成功表達，下一步將進行該酶的體外活性研究。