持續性疼痛中“應對反應”行為相關通路的確定

一、研究背景

在動物和人類面對傷害性刺激的反應中，“反射性防御反應”是機體表現出防止或阻止傷害刺激的行為（例如，動物和人在接觸到傷害性熱刺激時會快速縮手），這是機體保護的第一道防線；當“反射性防御反應”構成的第一道防線未能阻止組織損傷時（例如，手指被燒傷），由此產生的疼痛會引發機體保護的第二道防線—“應對反應”行為，并通過產生“應對反應”來緩解癥狀（例如，舔舐受傷區域以緩解痛苦）。然而，參與這兩種行為的神經通路及其作用機制依然是不清楚。

前激素肽原1 (preprotachykinin 1, TAC1) 基因表達在參與傷害刺激反應的脊髓神經元中。研究人員使用 TAC1Cre小鼠來表征脊髓 TAC1-譜系神經元，并獲得了TAC1Cre-tdTomato小鼠、CDX2Flpo-tdTomato小鼠（Flpo 從 CDX2基因位點驅動, 能夠切割FRT位點，使終止子之后的tdTomato表達）和TAC1CDX2-tdTomato小鼠（大腦中的所有tdTomato+纖維起源于TAC1Cre和CDX2Flpo共表達所定義的脊髓TAC1CDX2神經元）用來標記與疼痛相關的特異性上行投射神經元。

二、主要研究結果

1.TAC1Cre標記的纖維是脊髓丘腦投射神經元的子集，主要終止于內側丘腦

為了研究疼痛相關行為的上行投射神經元，作者利用分子遺傳技術得到了 TAC1CDX2-tdTomato 小鼠。這種小鼠的大腦中所有 tdTomato+纖維都來源于脊髓 TAC1CDX2神經元，TAC1CDX2神經元既表達TAC1Cre又表達CDX2Flpo。研究人員通過免疫熒光染色發現，CDX2Flpo標記的纖維廣泛分布于丘腦腹后外側核；TAC1CDX2標記的纖維主要分布在室旁、內側丘腦核與外側核的最內側部分；TAC1Cre標記的脊髓投射神經元是脊髓丘腦投射神經元的一個子集，在TAC1Cre標記的脊髓上行纖維主要終止在內側丘腦，沒有在腹后外側核中發現TAC1Cre標記的纖維，因此，TAC1Cre標記的脊髓神經元上行到丘腦終止在丘腦內側，構成上行感覺的內側丘腦通路。

2.脊髓TAC1譜系神經元與PBsl之間通過選擇性突觸連接，直接或間接連接丘腦內核

腦橋臂旁外側核是沿背腹軸排列的一個關鍵中轉站，位于臂旁外側核腹側外亞核(the external lateral parabrachial nuclei, PBel) 是腦橋臂旁外側核的重要成份。為了確定PBel投射神經元在疼痛中的作用，作者將降鈣素相關肽基因(calcitonin-gene related peptide,CGRP)表達在這類神經元上，被標記的神經元然后投射到杏仁核，這些神經元對于應對外部威脅的快速防御反應至關重要。臂旁外側核腹亞核 (the dorsoventral lateral parabrachial nuclei, PBdvl) 參與熱行為調節；位于最背側位置的臂旁外側核上亞核 (the superior lateral parabrachial nuclei, PBsl)則參與疼痛刺激的行為反應。通過免疫熒光染色，研究人員發現, TAC1CDX2標記的纖維通過腦橋臂旁外側核區域PBel和PBdvl側面，終止于PBsl，TAC1Cre神經元與PBsl之間形成特異性突觸連接。PBsl 神經元投射到丘腦內核，但不投射到杏仁核。因此，脊髓 TAC1譜系神經元包括其上升投射神經元，直接或間接地連接到丘腦內核。

3.TAC1LBX1神經元對小鼠功能影響的研究

為了進行功能研究，研究人員通過使用TAC1Cre和LBX1F1po（下文稱為TAC1LBX1）共表達的脊髓神經元來表征人白喉毒素受體DTR。TAC1LBX1神經元的消融是通過對攜帶tdTomato等位基因的小鼠體內注射白喉毒素來完成，在小鼠注射白喉毒素后，攜帶白喉毒素基因的陽性神經元被選擇性消融，導致脊髓tdTomato+神經元大量減少。白喉毒素消融的神經元也出現在三叉神經核中，但在背根神經節或其它腦區域沒有被發現。為了證明TAC1LBX1神經元的功能特性，研究者選擇了TAC1LBX1-Abl小鼠和同窩WT小鼠作為對照，對兩組小鼠的轉棒延遲(falling latencies from the rotarod)、溫和刷子刺激(gentle hindpaw brushing)行為反應進行了比較研究，結果發現它們之間沒有顯著性差異。證明TAC1LBX1神經元的消融并不影響感覺運動協調，也不參與無害觸覺刺激的反應。

4.TAC1LBX1神經元是“應對反應”的必需神經元，但不參與“反射性防御反應”

行為學研究表明，當TAC1LBX1消融小鼠和野生型小鼠（對照）給予機械刺激、傷害性瞬時冷刺激和熱刺激時，兩組小鼠縮爪反應的閾值（潛伏期）未發生顯著變化；當給予電刺激時，對照組和TAC1LBX1神經元消融小鼠行為反應也沒有顯著性差異。雖然，PBdv1 中的神經元對于行為體溫調節是必需的，但對照和TAC1LBX1消融的小鼠并不表現出明顯的溫度偏好。因此，研究人員得出結論：TAC1LBX1神經元對于外部威脅引起的“反射性防御反應”是非必需的。然而，在能夠產生組織損傷和疼痛感覺的持續性有害熱刺激和冷刺激、足底注射TRPA1激動劑芥子油、后爪燒傷模擬等行為學測試中，TAC1LBX1神經元消融小鼠的“應對反應”大大降低，證明TAC1LBX1神經元對于不可避免的傷害刺激引起的“應對反應”是必需的。

5.持續“應對反應”的選擇性喪失與人類內側丘腦核病變所見“表型”一致

根據人體心理物理研究，用彈簧夾夾住皮膚會引起含有刺痛、疼痛和灼燒成分的疼痛感，人類持續疼痛評估和小鼠舔的行為在10～15 s內都會到達一個峰值，并且在接下來的一分鐘內都會維持這個峰值水平。在TAC1LBX1消融小鼠中，這種持續性舔行為已經喪失，小鼠的“應對反應”出現了障礙，這一現象表明TAC1LBX1神經元參與了小鼠的“應對反應”。夾捏刺激能夠誘導小鼠脊髓背角和由脊髓TAC1譜系神經元支配的兩個腦核中（PBs1和內側丘腦復合體）Fos基因的表達，而該表達在TAC1LBX1消融的小鼠中大大減弱。表明情感痛苦的持續“應對反應”的選擇性喪失與內側丘腦核病變的人類所見的表型相同，暗示：脊髓TAC1神經元與其所支配的腦核具有直接或間接的聯系。

6.TAC1LBX1神經元與持續疼痛刺激和熱輻射刺激所誘發“應對反應”的關系

前期研究表明，條件性位置厭惡(conditioned place aversion, CPA)實驗能夠刺激TAC1Cre的上行投射神經元，使小鼠產生厭惡反應和厭惡記憶，進而產生應對反應。由此，研究人員開發了一種夾捏誘發的CPA模型，在固定隔室對小鼠給予夾捏皮膚刺激，測定不同組小鼠在該隔室的停留時間來確定小鼠是否產生CPA。實驗結果表明，雄雌對照同窩出生的小鼠都表現出夾捏對隔室的厭惡，而消融TAC1LBX1神經元的小鼠對這種刺激很不敏感；進一步研究表明，能夠使小鼠產生縮足反應的重復輻射熱刺激在對照組或消融組小鼠中都沒有產生CPA，證明TAC1LBX1神經元對于由產生持續疼痛的刺激誘發的條件性學習和記憶是必需的，而對于熱輻射引起的反射性防御反應是非必需的，表達TAC1Cre上行投射系統的激活是產生CPA的原因。

7.TRPV1、MRGPRD與“反射性防御反應”和“應對反應”

TRPV1+傷害感受器對于皮膚夾捏、冷板刺激、熱板刺激或皮膚燒傷引起的舔行為是必需的，但不影響縮足反應；MRGPRD+傷害感受器消融導致縮足閾值增加但不影響小鼠的舔行為。研究人員發現，在TAC1Cre標記的神經元中，夾捏誘導的Fos表達在消除TRPV1+時減少，這表明這些神經元之間具有功能性聯系。值得注意的是，雖然TRPV1+傷害感受器對由有害熱引起的反射和舔行為都是必需的，但是這些行為中的每一個都可能涉及單獨的神經元群。通過應對試驗，研究人員發現與反射性防御試驗得出的結論相反：需要TRPV1+而不是MRGPRD+傷害感受器來驅動持續性機械疼痛。

三、結論

動物和人類對傷害刺激表現出兩種類型的反應，一種是“反射性防御反應”，另一種是“應對反應”。不論是“反射性防御反應”還是“應對反應”，傷害刺激傳遞主要有兩條通路，一是脊髓-丘腦通路，刺激信號由脊髓丘腦投射神經元的子集，終止于內側丘腦通路；二是從脊髓神經元，通過PBel和PBdvl側面連接PBsl，最終投射到丘腦內側細胞核，但并不投射到杏仁核。

TAC1LBX1神經元的消融并不影響感覺運動協調，也不參與無害觸覺刺激的反應，對外部威脅引起的“反射性防御反應”沒有影響；而對于不可避免的傷害刺激引起的“應對反應”是必需的。表明TAC1LBX1神經元是脊髓中介導“應對反應”行為的神經元。

TRPV1+傷害感受器在有害熱刺激引起的反射和舔行為中都發揮了作用；MRGPRD+傷害感受器只影響“防御性反射反應”，不參與驅動持續性機械疼痛。