長鏈非編碼核糖核酸及其介導的競爭內源性核糖核酸與卒中發病機制研究進展

陸小燕，范存秀，杜冰瀅，劉振宇，畢曉瑩

卒中是世界范圍內致殘和致死的主要原因之一，給社會和家庭帶來沉重的負擔，早期診斷和早期治療是降低卒中致殘率和死亡率的重要手段和方法[1]。研究表明，基因組、表觀遺傳組及轉錄相關的生物學標志物對卒中的早期診斷具有重要的意義。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度大于200堿基的非編碼RNA，可調控基因表達，參與多種生物學過程，如基因組印記、細胞分化、染色質修飾、轉錄激活、免疫應答，在疾病的發病機制中起到重要作用[2]。lncRNA、mRNA、假基因和環狀RNA都含有微小RNA（microRNA，miRNA）結合位點，可競爭性結合相同的miRNA，減輕miRNA對靶基因的抑制作用，這種作用機制稱為競爭內源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）假說[3]。多項研究表明l n c R N A 及其介導的ceRNA在卒中的發病機制中發揮作用。本文對lncRNA及其介導的ceRNA與卒中關系的研究進展進行綜述。

1 lncRNA與卒中關系的研究進展

1.1 lncRNA與缺血性卒中 缺血性卒中是卒中的主要類型，發病原因為腦血流的減少或中斷，引起缺氧、炎癥反應、氧化應激、興奮性氨基酸的神經毒性、腦水腫等級聯反應，導致神經細胞損傷甚至死亡[4]。研究表明多個lncRNA在缺血性卒中后異常表達，且lncRNA與缺血性卒中的發病及預后密切相關。Wenzhen He等[5]通過對缺血性卒中患者與正常對照者血液樣本進行RNA測序，發現61個lncRNA差異表達（14個表達上調，47個表達下調），通路分析顯示相關lncRNA參與了糖酵解、糖異生、黏著連接等生物學過程。J.Zhang等[6]通過對氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）16 h后的鼠腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMEC）進行RNA測序，發現362個lncRNA差異表達，其中147個lncRNA上調和70個lncRNA下調超過2倍。目前也有研究對具體的lncRNA與卒中患者的關系進行了研究，如研究顯示心肌梗死相關轉錄因子（myocardial infarction associated transcript，MIAT）在缺血性卒中患者外周血白細胞中表達較正常組升高，MIAT水平與入院時的NIHSS評分及入院3個月后mRS評分呈正相關（P均＜0.001）；MIAT水平較高的患者預后相對較差，MIAT可作為預測缺血性卒中預后的標志物[7]；INK4基因座的反義非編碼RNA（antisense non-coding RNA in the INK4 locus，ANRIL）在缺血性卒中患者中的表達水平較正常組顯著升高，且ANRIL的rs2383207和rs1333049遺傳位點變異增加中國漢族男性缺血性卒中的風險[8]。Jue Wang等[9]的基礎和臨床研究顯示lncRNA H19在大腦缺血再灌注的模型鼠及OGD/復氧（reoxygenation，R）誘導的細胞中表達上調，可通過雙特異性磷酸酶5（dual specificity phosphatase 5，DUSP5）-細胞外信號調節激酶1/2（extranal-signal regulated kinase1/2，ERK1/2）軸抑制自噬，抑制lncRNA H19從而減少OGD/R誘導的細胞死亡，其基因變異亦可增加患者缺血性卒中的風險。

血管生成是卒中后建立側支循環的重要條件，研究表明lncRNA可參與調控缺血性卒中后血管生成。lncRNA ANRIL在糖尿病合并腦梗死的大鼠腦組織中表達上調，過表達ANRIL可激活核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號通路，上調血管生長因子（vascular endothelial growth-factor，VEGF）及促進血管生成[10]。lncRNA母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）在大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠中表達顯著下降，沉默MEG3可增加血管內皮細胞遷移、增殖、出芽及微管形成進而促進新生血管形成，體內外實驗證明MEG3可負性調控Notch信號通路[11]。MEG3在OGD/R誘導的鼠BMEC中表達上調，可通過p53/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）軸介導卒中后血管生成；抑制MEG3可減少OGD/R誘導的細胞凋亡[12]。

lncRNA參與缺血性卒中的炎癥反應，在炎癥介導的神經細胞損傷中起到重要作用。循環lncRNA H19在卒中患者中表達較正常組升高，且與患者NIHSS評分及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平呈正相關；H19在MCAO模型鼠的血漿、白細胞及腦組織中表達上調，腦內注射H19干擾性小核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）可減輕卒中24 h后的腦梗死體積，減輕腦水腫，降低TNF-α、白細胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）等炎癥因子水平；敲除H19可減輕卒中后14 d的動物腦組織損失及神經功能缺損[13]。lncRNA Gm4419在OGD/R誘導的小膠質細胞中表達上調，過表達Gm4419可促進核轉錄因子κB抑制蛋白α（inhibitor of nuclear factor kappa-B α，IκBα）磷酸化，升高NF-κB水平，進而轉錄激活TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子；敲低Gm4419基因后可抑制NF-κB的表達，對OGD/R損傷具有保護作用，表明Gm4419通過活化NF-κB信號通路在小膠質細胞OGD/R損傷中起到重要作用[14]。lncRNA鈣/鈣調蛋白依賴蛋白激酶相關轉錄因子1（calcium/calmodulin-dependent protein kinase associated transcript 1，C2dat1）在MCAO小鼠模型的缺血半暗帶中表達上調，敲低C2dat1可致鈣調蛋白依賴蛋白激酶Ⅱδ（calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ delta，CaMKⅡδ）表達下降且增加OGD/R誘導的細胞死亡，下調CaMKⅡδ可抑制OGD/R誘導的NF-κB信號通路活化；體外實驗證實沉默C2dat1可下調核轉錄因子κB抑制蛋白激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）α、IKKβ的表達及磷酸化，抑制IκBα降解，抑制NF-κB信號通路活化，表明C2dat1可通過NF-κB信號通路影響神經元的存活[15]。lncRNA同源盒基因轉錄反義RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）在缺血性腦梗死小鼠的梗死區域中表達顯著上調，可正性調控細胞凋亡，體外實驗證實沉默HOTAIR可提高缺血性腦梗死小鼠的腦功能，顯著減少循環中NADPH氧化酶2（NADPH oxidase 2，NOX2）的產生[16]。lncRNA功能性基因RNA元件（functional intergenic repeating RNA element，FIRRE）在OGD/R治療的小膠質細胞中表達上調，上調FIRRE可通過提高IκBα的水平激活NF-κB信號通路，導致小膠質細胞損傷；沉默F I R R E 可抑制NF-κB信號通路活化[17]。lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在OGD誘導的小鼠BMEC及MCAO小鼠的大腦微血管中表達上調，沉默MALAT1可增加促凋亡因子Bim和促炎癥因子單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、IL-6和E-選擇素（E-selectin）的表達，增加OGD誘導的BMEC死亡和Caspase 3的活性；體內實驗證明敲除MALAT1可增加MCAO小鼠腦梗死體積，導致神經功能惡化[18]。lncRNA Fos下游轉錄本（Fos downstream transcript，FosDT）在MCAO鼠模型中表達上調，局灶缺血可促進FosDT與SIN3轉錄調控蛋白家族成員A（SIN3 transcription regulator family memberA，Sin3A）和神經元限制性沉默因子輔助抑制因子（corepressor neuronrestrictive silence factor，CoREST）結合，體內實驗證明敲除FosDT基因可抑制神經元限制性沉默因子（neuron-restrictive silence factor，REST）下游基因α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA），谷氨酸受體-2受體亞基（receptor subunit GluR2，GRIA2）、核因子活化B細胞k輕鏈增強子2（NFκL chain enhancer of activated B cells 2，NFκB2）和 N-甲基-D-天氡氨酸離子能谷氨酸受體1（glutamate receptor，ionotropic，N-methyl D-aspartate 1，GRIN1）的表達，能顯著減輕缺血后運動神經元損傷及減少梗死體積[19]。

1.2 lncRNA與出血性卒中 lncRNA在出血性卒中的發病過程中起到重要的作用，研究表明lncRNA與顱內出血的炎性反應有關。lncRNA NF-κB相互作用lncRNA（NF-κB interacting lncRNA，NKILA）在膠原酶Ⅶ誘導顱內出血的大鼠中表達下調，抑制NKILA可顯著減輕內質網應激和自噬，激活NF-κB信號通路，減輕神經功能損傷、腦水腫及腦損傷[20]。lncRNA MEG3在蛛網膜下腔出血的患者中表達較正常對照組顯著升高，體外實驗證實MEG3表達升高可抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，Pi3k）/蘇氨酸激酶（threonineprotein kinase，Akt）通路進而降低神經細胞的活性并促進細胞凋亡[21]。Jianhua Peng等[22]通過對蛛網膜下腔出血24 h后的小鼠腦組織進行高通量測序發現617個lncRNA和441個mRNA較正常對照組差異表達，功能分析表明大多數差異表達的mRNA與炎癥相關；基于lncRNA/mRNA共表達網絡，敲低lncRNA fantom3l-F730004F19基因可減少CD14、Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）的表達并減輕小膠質細胞的炎癥反應。lncRNA蛋白酪氨酸磷酸酶J反義RNA1（protein tyrosine phosphatase receptor type J-antisense RNA 1，Ptprj-as1）在顱內出血的大鼠腦組織中表達顯著上調，過表達Ptprj-as1可激活NF-κB信號通路，促進BV2細胞遷移，增加促進炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）及一氧化氮（nitric oxide，NO）的表達，表明Ptprj-as1可參與顱內出血引起的炎癥損傷[23]。

2 lncRNA介導的ceRNA在卒中發病機制中的作用

lncRNA介導的ceRNA主要基于lncRNA含有miRNA結合位點，可吸附miRNA，減少miRNA對靶基因的抑制作用。由于目前尚缺乏lncRNA介導的ceRNA與出血性卒中的相關研究，下文主要闡述lncRNA介導的ceRNA在缺血性卒中發病機制中的作用。

研究表明lncRNA介導的ceRNA參與了缺血性卒中的炎癥反應、血管生成及神經細胞凋亡等過程。lncRNA生長停滯敏感轉錄本5（growth arrest-specific transcript 5，GAS5）在MCAO模型鼠及OGD誘導的神經元中表達上調，研究表明GAS5與Notch1競爭結合miR-137位點，敲低GAS5基因可上調miR-137及降低miR-137靶基因Notch1表達，增加神經細胞的活性及減少OGD誘導的神經元凋亡[24]。lncRNA牛磺酸上調基因1（taurineupregulated gene 1，TUG1）在MCAO大鼠的缺血半暗帶及OGD誘導的神經元中表達顯著上調，體外實驗證實敲除TUG1基因可上調miR-9及降低miR-9靶基因Bcl2樣蛋白11（Bcl-2-like protein11，Bcl2l11）的表達，減少細胞凋亡[25]。lncRNA MALAT1在MCAO模型鼠及OGD誘導的神經元中表達顯著上調，體內外實驗表明上調MALAT1可降低miR-30a表達及增加miR-30a靶基因Beclin1表達，下調MALAT1可抑制Beclin1依賴的自噬進而減少神經細胞死亡[26]。另一研究表明MALAT1可與miR-26b結合，下調miR-26b的表達，進而增加miR-26b靶基因unc-51樣激酶2（unc-51 like kinase 2，ULK2）的表達，促進OGD/R誘導下BMEC自噬及存活[27]。lncRNA低氧誘導因子1α反義RNA2（hypoxia inducible factor 1α-antisense RNA 2，HIF1A-AS2）在低氧誘導的人臍靜脈內皮細胞的表達升高，HIF1A-AS可吸附miR-153-3p并降低miR-153-3p水平，增加低氧誘導因子α（hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α）的表達，促進血管生成[28]。lncRNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）在OGD誘導的BMEC中表達升高，SNHG1可與miR-199a直接結合，過表達SNHG1可減輕miR-199a對HIF-1α和VEGF的抑制作用，促進BMEC細胞存活以及血管生成[29]。另一研究表明SNHG1在MCAO小鼠中表達顯著上調，抑制SNHG1可增加MCAO小鼠梗死體積及惡化神經功能，在OGD培養的BMEC中抑制SNHG1可顯著提高caspase-3的活性及促進細胞凋亡；研究表明過表達SNHG1可下調miR-18a，解除miR-18a對HIF-1α的抑制作用，促進BMEC存活[30]。lncRNA小核仁RNA宿主基因14（small nucleolar RNA host gene 14，SNHG14）在缺血性腦組織及OGD制備的小膠質細胞系中表達顯著升高，SNHG14過表達后可降低miR-145-5p水平，增加miR-145-5p靶基因磷脂酶A2組4A（Phospholipase A2 Group 4A，PLA2G4A）表達，促進小膠質細胞激活，增加TNF-α、NO的表達及神經元凋亡，加重神經元損傷[31]。lncRNA MEG3可作為ceRNA與程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）競爭miR-21的結合位點，過表達miR-21可減少OGD/R誘導的細胞死亡；體內實驗表明敲除MEG3后可減輕缺血損傷及提高神經功能，表明MEG3可作為ceRNA靶向miR-21/PDCD4信號通路進而調控缺血神經細胞功能[32]。lncRNA叉頭蛋白F1毗連非編碼發育調控RNA（forkhead box F1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA，FENDRR）在高血壓顱內出血小鼠的血管內皮細胞中表達下調，過表達FENDRR可通過降低靶向miR-126調控血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）進而促進血管內皮細胞的凋亡[33]。

隨著人們對lncRNA的關注，lncRNA在腦血管疾病等疾病中異常表達，可直接參與疾病的發病過程或者介導ceRNA參與疾病的發病機制。現有研究為揭示lncRNA及其介導的ceRNA在卒中發病機制中的研究提供了方向，未來必將有更多的lncRNA及其介導的ceRNA被發現與卒中關聯。深入研究lncRNA及其介導的ceRNA與卒中的發病機制，可為卒中的預防、治療及預后判斷提供新的思路。

【點睛】基礎和臨床研究逐漸發現了越來越多的與卒中相關的長鏈非編碼RNA及其介導的競爭內源性RNA，對其機制的研究有助于更深層次地理解卒中發生發展的機制并進行相應診療。