不同誘導條件對樹鼩骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的影響*

苗雨潤 李 娜 匡德宣 宋慶凱 袁 圓王 璇 張志成 陸彩霞

（1.中國醫學科學院/北京協和醫學院，醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，昆明 650118）（2.河套學院醫學系，內蒙古自治區蜱媒人畜共患傳染病重點實驗室，巴彥淖爾市 015000）

樹鼩骨髓間充質干細胞（BM-MSCs）具有廣泛的多分化潛能，可通過如化學藥物、物理環境改變、細胞因子等多種方式誘導其分化[1]。其具有來源廣泛、病原微生物感染率低，生物學性能穩定、免疫原性較低和負性免疫調節作用，同種異體移植免疫排斥反應較低，不產生移植物抗宿主病等優點[2]，是自體干細胞移植治療和構建組織工程器官的理想種子細胞，為組織工程學與再生醫學提供了新思路。樹鼩作為一種新型實驗動物，由于其在分類學上比嚙齒類與人類更相近，且繁殖飼養難度要簡單于獼猴類，近年來受到廣泛關注，被廣泛應用于人類疾病模型的構建及相關領域的研究[3]，我們之前已成功將樹鼩BM-MSCs進行了分離培養及鑒定，但由于不同物種的BM-MSCs對相同誘導劑反應性的不同，樹鼩BM-MSCs向成骨誘導過程中，市售的其他物種的成骨誘導液均不能很好地達到成骨誘導的目的，現有的間充質干細胞成骨誘導分化培養基存在對樹鼩骨髓間充質干細胞誘導效率不理想、成骨誘導分化的專一性不強、無法成功誘導成骨分化的問題。所以我們一直致力于尋找可以應用于樹鼩BM-MSCs誘導分化為成骨細胞的最高效的誘導方法[4]。本實驗初步探討了不同濃度的化學藥物及細胞因子對骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化能力的影響并加以鑒定，研究其形態特征和反應性差異，探索樹鼩BM-MSCs向成骨細胞分化的最佳誘導培養方法，有望開發一種針對樹鼩BM-MSCs的成骨誘導分化培養鑒定的試劑盒，為樹鼩骨髓BM-MSCs應用于人類相關疾病的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

F1代成年樹鼩雌雄不限，體質量110～130 g，來自中國醫學科學院醫學生物學研究所，實驗動物生產許可證 SCXK（滇）K2013-0001，使用許可證SYXK（滇）K2013-0001。

1.2 主要試劑及儀器

人淋巴細胞分離液（灝洋生物制品有限公司，天津），DMEM/F12（Thermo，美國），高糖 DMEM（HyClone，美國），DMEM（HyClone，美國），胎牛血清（HyClone，美國），地塞米松（Enzo，美國），維生素 C（Solarbio，北京），β-磷酸甘油鈉（Sigma，美國），DMSO（Sigma，美 國），茜 素 紅 （Solarbio，北 京），BMP-2（PeproTech，美國），堿性磷酸酶試劑盒（西亞試劑，山東），胰酶（BI，以色列），肝素鈉（Sigma，美國），青霉素（HyClone，美國），鏈霉素（HyClone，美國），倒置顯微鏡（Nikon，日本），二氧化碳孵箱（Thermo，美國）。

1.3 BM-M SCs細胞

由本實驗室分離鑒定保存[4]。

1.4 實驗方法

1.4.1 樹鼩BM-MSCs成骨細胞誘導：取第3代樹鼩BM-MSCs，0.25%胰酶消化后以1x104個/m L接種12孔板，常規培養基培養細胞貼壁融合至90%后，分7組進行誘導，各組培養液配方參照表1。每隔48 h換液，誘導18 d后進行堿性磷酸酶和茜素紅染色。

表1 誘導培養液的配方優化Table 1 Optim ization of form ulation of differetiation cultu rem edium

1.4.2 茜素紅染色：分別取P3代細胞和P3代誘導培養18 d的7組細胞，用 PBS（pH7.2～7.4）洗2～3次，每次2 min；95%乙醇室溫固定10 min，雙蒸水洗滌3次；1%茜素紅-Tris-HCL，每孔 500～1 000 μL，37 ℃，30 m in；雙蒸水洗滌 4 次，每次 5 m in；加入雙蒸水1 m L，顯微鏡下觀察。

1.4.3 堿性磷酸酶染色：分別取P3代細胞和P3代細胞誘導18 d后的7組細胞，用PBS（pH7.2～7.4）洗2～3次，每次2 m in；95%乙醇室溫固定10 m in，雙蒸水洗滌3次；用堿性磷酸酶試劑盒染色，雙蒸水洗滌4次，每次5 min；加入雙蒸水1 mL，顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 樹鼩BM-M SCs在不同誘導條件下向成骨細胞分化的堿性磷酸酶染色結果

P3代樹鼩BM-MSCs在不同誘導條件下體外成骨誘導18 d后，ALP染色結果見圖1。如圖1所示，加入成骨誘導液的P3代細胞，在進行成骨誘導18 d后，堿性磷酸酯酶染色大多為陽性（圖1）。說明樹鼩BM-MSCs成骨誘導18 d，已具有成骨細胞的特征。由于ALP染色步驟及方法完全相同，故采用染色深淺度作為衡量分化優劣的標準，結果顯示不同組別的ALP染色結果差異較大，可以看出A、B組的染色結果明顯優于其余五組，這說明這兩組誘導培養液更適于樹鼩BM-MSCs的體外成骨誘導培養。

2.2 樹鼩BM-M SCs在不同誘導條件下向成骨細胞分化的茜素紅染色結果

圖1 樹鼩骨髓間充質干細胞成骨誘導第18天后堿性磷酸酶染色結果Fig.1 Ostepgenic induction of Tupaia bone m ar row m esenchym al stem cells at 18 d by alkaline phosphatase staining

圖2 樹鼩骨髓間充質干細胞成骨誘導第18天后茜素紅染色Fig.2 Ostepgenic induction of Tupaia bone m arrow m esenchym al stem cells at 18 d by alizarin red staining.

P3代樹鼩BM-MSCs分別在不同組別誘導培養液的條件下體外成骨誘導18 d后，茜素紅染色結果如圖2所示。加入成骨誘導培養液的P3代BMMSCs細胞，其細胞形態由梭形形態逐漸轉變為三角形、方形、鱗片狀等，在成骨誘導18 d時形成鈣化結節，茜素紅染色陽性（圖2）說明此時樹鼩 BM-MSCs成骨誘導成功，已形成成熟的成骨細胞。在 A、B、C、D、E組都觀察到有不同數量程度的明顯的鈣化結節，這證明樹鼩BM-MSCs被成功地誘導為成熟的成骨細胞。但組別不同，其誘導程度也呈現明顯差異。通過血球計數板計算在相同細胞數的前提下有多少個礦質結節形成作為評價分化標準，結果顯示A、B組誘導培養液的誘導效果明顯優于其余五組誘導培養液，此染色結果與 ALP染色結果基本相同，說明A、B這兩組培養液的誘導效率更佳。

3 討論

BM-MSCs可以通過不同的方法誘導為成骨細胞，其相關實驗的可行性在人、大鼠、小鼠、兔、犬、猴、山羊等不同物種間先后得到驗證[5]。王善正等[6]通過用自體富血小板血漿在體外培養兔的BMSCs，發現經自體激活富血小板血漿誘導的 BMMSCsⅡ型膠原α1鏈基因和聚集蛋白聚糖基因表達明顯增高，證明自體激活富血小板血漿具有促進兔BM-MSCs向軟骨細胞方向分化的潛能。近年來使用中藥成骨誘導骨髓間充質干細胞也是一大研究熱點，武密山等[7]，顧巧麗等[8]，及楊淵等[9]分別使用川續斷皂苷VI、姜黃素及柚皮甙成功實現不同動物的BM-MSCs向成骨細胞的誘導。黃曉丹等[10]發現雷奈酸鍶可通過TGF-β1/Smad通路促進大鼠BMMSCs向成骨細胞分化。此外還有許多方法可以將BM-MSCs成骨誘導，現最經典也是最常用的誘導方法有兩種，即地塞米松與β-磷酸甘油鈉作為誘導物及使用BMP-2作為誘導物進行誘導培養。有報道證明，BMP-2的激活渠道包括Smads途徑與MAPKs途徑[11]。BMP-2的信號通過這兩條途徑均可傳入細胞，激活轉錄因子 Dlx5，Cbfa1和 Osx，來啟動成骨細胞特異性的基因表達[12]。而化學誘導培養液中的地塞米松的作用是抑制細胞增殖，限制細胞分化，并通過激活Osx來實現信號傳導，從而實現誘導分化功能。β-磷酸甘油鈉的主要功能是為細胞形成礦物結節提供磷元素，維生素C則與在礦化結節的形成過程中的膠原合成直接相關[13]。本研究選擇了最常用也是公認誘導效率最高的這兩種方法進行研究，來探索將樹鼩BM-MSCs誘導分化為成骨細胞的最佳配比的誘導培養液。

本研究采用本實驗室分離保存的樹鼩BMMSCs，使用7種不同配比的誘導培養液對樹鼩BMMSCs進行成骨誘導培養，并使用ALP染色及茜素紅染色的方法來鑒定誘導結果及不同誘導培養液的誘導效率。通過ALP染色及茜素紅染色的結果來評估成骨誘導分化結果，結果顯示 A組及 B組在ALP染色結果中比其余各組陽性染色結果更佳，且在相同計數細胞的前提下可以形成更多的礦質結節。化學藥物抗壞血酸、地塞米松及β-磷酸甘油鈉和細胞因子BMP-2都可以將樹鼩BM-MSCs誘導為成骨細胞，但不同配比的誘導結果具有顯著差異。結果顯示，高糖DMEM培養液相對于 DMEM/F12培養液來說更適合作為誘導培養液的基礎培養液。100μmol/L維生素 C+1μmol/L地塞米松 +10 mmol/Lβ-磷酸甘油鈉的配比配制（即A組）的誘導培養液在誘導培養18 d后，ALP染色陽性，呈現大量的鈣化結節，其誘導結果顯著優于其他化學藥物誘導組，是樹鼩BM-MSCs誘導分化為成骨細胞的最適合的化學藥物誘導培養液。細胞因子方面，50ng/m L的BMP-2即可成功將樹鼩BM-MSCs誘導為成骨細胞，BMP-2濃度過高并不見得具有更佳的誘導作用。A組化學藥物誘導培養液與B組（50ng/m L的BMP-2）細胞因子誘導培養液兩者間的誘導結果并無顯著差異，值得一提的是，D組培養液結合維生素C、β-磷酸甘油鈉及 BMP-2兩種不同類型的誘導物，并沒有呈現更佳的誘導結果，出現這種情況也許與兩者的濃度配比有關，也不排除是由于缺少地塞米松的刺激，也有可能是這兩種不同類型的誘導物有拮抗作用，具體原因仍需要相關實驗驗證。

本研究通過對比不同誘導條件對樹鼩BMMSCs向成骨細胞分化的影響，探討最適配比的誘導培養液配方，實驗結果為樹鼩BM-MSCs向成骨細胞分化的相關研究提供了一定的指導依據，為開發針對樹鼩BM-MSCs的成骨誘導分化培養及鑒定的試劑盒提供實驗依據，也為樹鼩BM-MSCs應用于人類相關疾病研究奠定了基礎[14]。