糖皮質激素性骨質疏松模型大鼠在性別上的差異性研究*

鐘志勇 梁志健 劉月姝 李思婷 梁冠澤 謝超敏 唐小江

（廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248）

骨質疏松是一種以骨量減少、骨纖維結構發生退行性病變為主要特征，可導致患者骨折風險增加的全身性骨骼系統疾病。目前骨質疏松患者已超過2億，居世界常見疾病的第七位[1]。研發治療骨質疏松新型、高效、價格低廉的藥物首先是建立可靠的實驗動物模型。目前，糖皮質激素性骨質疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）模型多用于模擬臨床上因使用糖皮質激素所導致的繼發性骨質疏松的發生。對于GIOP模型，其發生的機理、常用的藥物及其劑量等已有報道[2-5]，但動物性別對GIOP模型的影響卻鮮有研究。故本研究采用兩種性別的SD大鼠分別給予地塞米松以制備GIOP模型，比較不同性別的GIOP大鼠模型的區別，完善GIOP模型的背景數據，為模型的應用提供資料參考。

1 材料與方法

1.1 主要藥物及試劑

地塞米松磷酸鈉注射液（廣東三才石岐制藥有限公司，批號 20140763）；Rat 1，25-dihydroxyvitamin D3 ELISA Kit（武漢華美生物工程有限公司，批號：C1001070151）；Rat Calcitonin ELISA Kit（武漢華美生物工程有限公司，批號：T02011771）。

1.2 主要實驗儀器

7020型全自動生化分析儀，日本株式會社日立高新技術；Multiskan GO全波長酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific；Unigamma M骨密度儀，意大利 l'acn；QX-W400型電子萬能試驗機，上海企想檢測儀器有限公司；RM2235型輪轉切片機，德國 LEICA?；TS-12C型生物組織全自動脫水機，湖北孝感醫用儀器有限公司；EG1150型生物組織包埋機，德國LEICA?；CS-Ⅵ型攤片烤片機，湖北孝感醫用儀器有限公司；BX43型生物顯微鏡，日本 OLYMPUS?；CellSens Standard顯微圖像軟件，日本OLYMPUS?。

1.3 實驗動物

SPF級SD大鼠24只，雌雄各半，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證明編號：44007200023787、44007200023788。動物飼養條件：6只/箱，群養，溫度與濕度分別為 20～26℃、40%～70%，采用10 h：14 h晝夜間斷照明，自由進食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗證明編號：00117781、00117782。

1.4 實驗方法

SD大鼠常規飼養至3月齡后，隨機分為正常對照組和骨質疏松組，12只/組，雌雄各半。骨質疏松組雌性大鼠和雄性大鼠在第1天～第21天按2.5 mg/kg體質量，第22天 ～第63天按1 mg/kg體質量肌肉注射地塞米松磷酸鈉注射液，1次/2 d，持續9周。末次注射后1 h，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉（劑量為45 mg/kg），腹主動脈取血，分離血清，-80℃保存。取雙側股骨和腰椎 L4，進行骨密度和生物力學檢查；取脛骨，10%中性甲醛固定，進行病理組織學檢查。

1.5 指標的檢測

1.5.1 骨密度測定：取上述右側股骨和腰椎L4置于Unigamma M骨密度儀，應用軟件中的小動物對進行掃描，測定骨密度值（bone mineral density，BMD）。

1.5.2 骨生物力學測定：采用三點彎曲法，取上述凍存的左側股骨，室溫下復溫，置于QX-W400型電子萬能試驗機，跨距為20.00 mm，加載速度為2.00 mm/min，下壓于股骨中段，至股骨斷裂。記錄彈性載荷、最大載荷、彈性橈度，并用游標卡尺測量股骨斷面的最大內、外徑和最小內、外徑。根據公式計算股骨的彎曲彈性模量、最大彎曲應力、最大應變、骨剛性系數。

截面慣性矩：J=π（BH3-bh3）/64；最大彎曲應力：σb=FmaxLH/8 J；最大應變 εb=12dmaxH/2L2：骨剛性系數：EJ=FpL3/48dp。（B為股骨測量橫斷面的最大外徑，H為股骨測量橫斷面的最小外徑，b為股骨測量橫斷面的最大內徑，h為股骨測量橫斷面的最小內徑、Fp為彈性載荷，L為跨距，J為截面慣性矩，dp為彈性橈度、Fmax為最大載荷，dmax為最大撓度）

1.5.3 血清生化指標測定：取上述血清，按照ELISA試劑盒說明書，測定其中維生素 D3、降鈣素的含量；運用全自動生化儀測定其中 ALP、Ca、P的含量。

1.5.4 脛骨的病理檢測：取上述浸泡于10%中性甲醛固定液中的脛骨，經脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色等操作，然后觀察骨皮質是否變薄，骨小梁是否減少、疏松、變細、斷裂，成骨細胞是否減少、破骨細胞是否增多，并逐項進行評分，評分標準為：“0”分表示H.E染色結果基本正常；“1”分表示H.E染色結果偶見輕微病變；“2”分表示H.E染色結果輕度病變，范圍≦1/4視野；“3”分表示H.E染色結果中度病變，范圍≦1/2視野；“4”分表示H.E染色結果重度病變，病變范圍≧3/4視野；如觀察結果在“0～1”之間，則可記為“0.5”分，依次類推。計算每只動物脛骨各項病理變化的總積分。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 體質量結果

與正常對照組比較，骨質疏松組動物體質量在第7天 ～第 63天降低，具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 動物體質量變化Fig.1 Anim al weight from d0 to d63

2.2 血清 ALP、Ca、P檢測結果

與正常對照組比較，骨質疏松組動物ALP上升、雄鼠的Ca、P下降，差異具有統計學意義（P＜0.05或0.01）；其余指標無統計學意義（P＞0.05），見表 1。

表1 性別對G IOP大鼠ALP、Ca、P的影響（±s±s，n=6）Table 1 Effect of Sex on ALP，Ca and P of G IOP rat（ ±s ±s，n=6）

表1 性別對G IOP大鼠ALP、Ca、P的影響（±s±s，n=6）Table 1 Effect of Sex on ALP，Ca and P of G IOP rat（ ±s ±s，n=6）

注：與正常對照組同性別比較，a P＜0.05，aa P＜0.01Note：Compare with same gender rats of normal control group，a P＜0.05，aa P＜0.01

組別 性別 ALP/（U/L）Ca/（mmol/L）P/（mmol/L）正常對照組2.41±0.05 2.16±0.47骨質疏松組♂ 142.2±19.3 2.44±0.04 2.42±0.50♀ 71.3±13.7 2.46±0.07 2.26±0.25♂ 170.7±23.3a 2.32±0.07aa 1.86±0.32a♀ 115.0±36.1a

2.3 血清降鈣素、維生素D3檢測結果

與正常對照組比較，骨質疏松組雄鼠的降鈣素下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）。其余指標未見統計學差異，見表2。

2.4 股骨、椎骨BM D檢測結果

第21天時，骨質疏松組動物的BMD高于正常對照組；第41天時，骨質疏松組動物BMD開始低于正常對照組。在結束實驗第63天時，骨質疏松組動物的股骨BMD低于正常對照組，且骨質疏松組的雄鼠腰椎L4 BMD亦低于正常對照組，均具有統計學意義（P＜0.05或 0.01），見表3。

表2 性別對GIOP大鼠降鈣素、維生素D3的影響（±s±s，n=6）Tab le 2 Effect of Sex on calcitonin and vitam in D3 of GIOP rat（±s±s，n=6）

表2 性別對GIOP大鼠降鈣素、維生素D3的影響（±s±s，n=6）Tab le 2 Effect of Sex on calcitonin and vitam in D3 of GIOP rat（±s±s，n=6）

組別 性別 降鈣素/（fmol/L）維生素D3/（1 ×103 fmol/L）正常對照組 ♂ 4.63±1.55 62.3±28.5♀ 4.21±2.53 57.8±26.0♂ 2.01±0.61aa 48.5±19.6♀骨質疏松組3.58±1.73 39.5±17.6

表3 性別對G IOP大鼠股骨、腰椎L4 BM D的影響（±s ±s，n=6）Tab le 3 Effect of Sex on BM D of fem ur and L 4 of GIOP RAT（±s ±s，n=6）

表3 性別對G IOP大鼠股骨、腰椎L4 BM D的影響（±s ±s，n=6）Tab le 3 Effect of Sex on BM D of fem ur and L 4 of GIOP RAT（±s ±s，n=6）

注：與正常對照組同性別比較，a P＜0.05，aa P＜0.01Note：Compare with same gender rats of normal control group，a P＜0.05，aa P＜0.01

正常對照組骨質疏松組♂ 0.602±0.053 0.860±0.133♀ 0.536±0.035 0.659±0.068♂ 0.506±0.040a 0.705±0.051aa♀ 0.444±0.023a 0.597±0.037

2.5 彎曲彈性模量、最大彎曲應力、最大應變和最大負荷檢測結果

與正常對照組比較，骨質疏松組雄鼠最大應變、最大負荷下降，具有統計學意義（P＜0.05或0.01）。其余指標未見統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 性別對G IOP大鼠骨生物力學指標的影響（±s±s）Table 4 Effect of Sex on biom echanical index of G IOP RAT（ ±s ±s）

表4 性別對G IOP大鼠骨生物力學指標的影響（±s±s）Table 4 Effect of Sex on biom echanical index of G IOP RAT（ ±s ±s）

注：與正常對照組同性別比較，a P＜0.05，aa P＜0.01Note： Compare with same gender rats of normal control group，a P＜0.05， aa P＜0.01

正常對照組130.0±34.9 0.13±0.02 9952±5503 177.3±26.5♀149.5±15.6 0.07±0.02 8655±3087 112.2±15.1♂骨質疏松組 ♂136.6±14.3 0.07±0.01 6923±3320 98.9±9.1 108.7±19.0 0.10±0.02a 7403±4365 110.6±18.8aa♀

2.6 脛骨病理組織學檢測結果

正常對照組動物脛骨結構正常，骨皮質未見變薄，骨小梁致密，骨小梁周圍可見成骨細胞、偶見破骨細胞，骨髓腔大小正常，骨骺可見大量透明軟骨及少量骨化的軟骨。骨質疏松組的雌雄動物均可見骨干變細、骨皮質變薄，骨髓腔面積縮小，骨小梁周圍成骨細胞減少、破骨細胞增多，骨骺未見明顯異常。且骨質疏松組動物脛骨各項病理評分和總積分均高于正常對照組，具有統計學意義（P＜0.05）。此外，骨質疏松組雄性動物的骨小梁較該組雌性的減少、疏松和變細，該項評分和總積分也相應升高，具有統計學意義（P＜0.05），見表 5、圖 2。

表5 性別對G IOP大鼠脛骨組織各項病理評分和總積分的影響（±s±s）Tab le 5 Effect of Sex on tibia pathological score of of G IOP RAT（ ±s ±s）

表5 性別對G IOP大鼠脛骨組織各項病理評分和總積分的影響（±s±s）Tab le 5 Effect of Sex on tibia pathological score of of G IOP RAT（ ±s ±s）

正常對照組0.2±0.4 0.3±0.3 0.0±0.0 0.0±0.0 0.1±0.2♀0.2±0.4 0.1±0.2 0.3±0.4 0.0±0.0 0.3±0.3♂骨質疏松組2.8±0.4a 2.8±0.4ab 2.8±0.4ab 3.3±0.8ab 2.8±0.4a♀2.1±0.9a 2.0±0.5a 2.1±0.7a 2.3±0.5a 2.4±0.8♂a

表5（續） 性別對G IOP大鼠脛骨組織各項病理評分和總積分的影響（±s±s）Table 5（Con tinued） Effect of Sex on tibia pathological score of of G IOP RAT（±s ±s）

表5（續） 性別對G IOP大鼠脛骨組織各項病理評分和總積分的影響（±s±s）Table 5（Con tinued） Effect of Sex on tibia pathological score of of G IOP RAT（±s ±s）

注：與正常對照組同性別比較，a P＜0.05；骨質疏松組雄性與雌性比較，b P＜0.05Note： Compare with the same gender rat of normal control group， a P＜0.05； compare with the female rat of osteoporosis group，b P＜0.05

正常對照組0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.5±0.4♀0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.8±0.8♂骨質疏松組3.2±0.4a 3.2±0.4a 0.0±0.0a 21.0±2.7ab♀3.1±0.5a 3.1±0.5a 0.0±0.0 17.1±3.1♂a

3 討論

骨質疏松可分為原發性、繼發性和特發性，其中繼發性骨質疏松是由于藥物或疾病引起的，如過量地使用糖皮質激素。目前，糖皮質激素廣泛應用于臨床，致使糖皮質激素引起的繼發性骨質疏松發病率增加。為了防治 GIOP、了解該病的發病機制，需建立可靠的GIOP動物模型并不斷完善該模型的背景數據。

目前用于制備GIOP模型的動物種類并沒有統一的規范，多見有嚙齒類小動物（大、小鼠）和大動物（兔、狗、豬等）。雖然大動物具有哈弗氏系統，與人類的骨骼系統更為相似，但考慮到動物的易得性和使用的廣泛性，故本實驗采用SD大鼠作為研究對象。SD大鼠在6～8周齡達到性成熟，約在3月齡達到體成熟，此時骨骼系統發育完成，骨量也相對穩定，故采取3月齡大鼠[6]。目前關于動物的性別對GIOP模型的影響少有報道，選擇何種性別以更好地制備GIOP模型成為開展研究首要解決的問題之一，而這正是本研究的目的。

在本實驗條件下，雌、雄 SD大鼠注射大劑量地塞米松后均出現了GIOP的一系列癥狀。與正常對照組比較，骨質疏松組的雄性大鼠出現了股骨、腰椎L4骨密度下降，血清中的 ALP升高，鈣、磷、降鈣素下降，股骨的最大應變和最大負荷下降，脛骨組織病理評分升高，均有統計學差異（P＜0.05）；而雌性大鼠僅出現股骨骨密度下降，ALP升高，脛骨組織病理評分升高，具有統計學差異（P＜0.05）。在脛骨骨組織病理檢測中，骨質疏松組雄鼠骨小梁較該組雌性的減少、疏松和變細，該項評分和病理總積分也顯著性地升高。故骨質疏松組中的雄鼠GIOP癥狀較雌鼠的明顯。這可能與雌鼠中雌激素對骨代謝過程的保護作用有關。因為一方面雌激素可通過基因組或非基因組途徑對骨形成起促進作用；另一方面，雌激素還可以抑制骨細胞的骨吸收作用[7-9]。有文獻報道，雌鼠去勢后體內缺乏雌激素，在糖皮質激素聯合誘導下，可縮短骨質疏松的成模時間，且骨量丟失增大[10-11]。而雄激素在骨量丟失方面的作用尚未證實，也未見雄激素與糖皮質激素協同作用的報道。故在制備單純的GIOP模型以研究糖皮質激素對骨骼系統的影響時，應考慮雌激素的影響。選擇雄性大鼠較雌性大鼠理想，因為這可避免雌激素的干擾，使GIOP模型更為明顯、穩定。