利用TALEN技術制備HE4（WFDC2）敲除小鼠模型*

龍華洋 孫 丹 李金萍 江世文，3

（1.首都醫科大學基礎醫學院遺傳與發育生物學系，北京 100069）（2.第四軍醫大學唐都醫院婦產科生殖醫學中心，西安 710038）（3.基礎醫學系，默索大學醫學院，紀念健康醫學中心，婦科與婦產科系，薩凡納，GA，美國，31404）（4.常州大學制藥與生命科學學院，常州 213164）

人附睪蛋白 4（Human epididymis protein 4，HE4）最初是在人附睪中被發現，并因此而得名[1]。此后HE4被證明是由人 Wfdc2（WAP four-disulfide core domain protein 2）基因編碼的一種分泌蛋白，因此HE4又名為 WFDC2[2]。另有研究報道，除了在人附睪中表達外，HE4也在其他正常組織器官中有表達，包括生殖系統，呼吸系統，并且HE4在氣管中表達最高，其余依次唾液腺，肺等組織[3-4]。

近年來，越來越多的研究指出，HE4在一些癌癥中高表達，包括卵巢癌[3，5-7]，肺癌[8-11]，子宮內膜癌[12]。因此認為HE4可以作為檢測這些癌癥的標志物。在HE4相關癌癥的研究中，HE4與卵巢癌的研究最受研究者關注。目前，CA125的含量仍然是檢測卵巢癌的金標準[13]，Hellstrom等[5]用卵巢癌患者血清中的 HE4水平來檢測卵巢癌，其結果與CA125有相同的靈敏性，并且用HE4作為檢測指標能提高惡性腫瘤檢測的特異性。Ghasem i[14]和Zhao等[15]指出，CA125聯合 HE4檢測可以提高卵巢癌檢測的敏感性和特異性。研究指出，HE4可能是促進卵巢癌細胞[16-17]和子宮內膜癌細胞[18]增殖的一個激活因子。而且，在癌細胞裸鼠異種移植實驗中，過表達HE4的腫瘤體積明顯大于對照組腫瘤[17]。上述研究提示，HE4高表達與腫瘤增殖有關，但是在正常組織中，HE4缺失的影響以及它正常的生理功能仍然不清楚。

基因敲除小鼠模型是研究動物基因功能的重要工具之一，小鼠的基因組與人類基因組相似度達90%，有99%的基因與人類基因同源[19]，并且表達HE4蛋白的人Wfdc2在如小鼠等一些物種間高度保守[3]，但目前尚無 WFDC2敲除小鼠模型來研究HE4的正常生理功能。

基因敲除技術的傳統方法是通過同源重組獲得基因敲除的ES細胞，然后通過嵌合體技術獲得基因敲除動物[20]，近幾年來興起的基因編輯工具包括鋅指核酸酶 ZFN技術[21]，轉錄激活因子樣效應物核酸酶TALEN技術[22]，成簇規律間隔的短回文重復序列CRISPR以及CRISPR相關蛋白系統CRISPR/Cas9技術[23]。本研究采用TALEN技術敲除C57BL/6 J小鼠Wfdc2基因，首次獲得WFDC2敲除小鼠模型，并發現純合WFDC2敲除小鼠出生后短時間內死亡，為進一步研究HE4的正常生理功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物由北京生命科學研究所轉基因動物中心提供。使用許可證號：SYXK（京）2015-002。所有實驗小鼠均在SPF級動物房飼養和繁殖。溫度控制在 22℃，濕度 70%，自動光周期（12 h明/12暗），自由采食和飲水。

1.2 主要試劑

Golden Gate TALEN assembly合成的質粒（Addgene），10X T4 DNA ligase buffer（NEB），T4 DNA ligase（NEB），限制性內切酶 Bsa I（NEB），Sac I，Esp3I（Fisher）質粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒、T載體試劑盒、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Life Technologies）。

1.3 TALENs位點設計

根據 NCBI上小鼠 Wfdc2基因序列，利用TALEN在線設計工具（http：//tale-nt.cac.cornell.edu）設計基因敲除位點。TALENs敲除靶序列如下：TALEN-L靶向序列5'-GCA CCA TGC CTG CCT G-3'，TALEN-R靶向序列 5'-AGT AGG AGG CCA GCG GC-3'。中間的 spacer序列為 5'-TCG CCT CTG CTT GCT G-3'。

1.4 TALENs載體構建

采用Golden gate法將識別靶序列的RVD模塊構建到載體上。然后將TALEN片段通過 Esp3I酶切構建到pCAG-T7-TALEN載體上，使得TALEN表達有 CAG或者 T7啟動子啟動，其中 CAG啟動TALENs在動物細胞中表達，T7啟動 TALENs體外轉錄成mRNA。將測序正確的TALENs表達載體采用無內毒素質粒提取試劑盒提取質粒備用。

1.5 體外轉錄

Sac I酶切 TALENs無內毒素質粒，電泳回收片段，并進行純化。以純化片段為模板，采用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit進行體外轉錄合成多聚腺苷酸化的mRNA。將體外轉錄的穩定mRNA用NucAway Spin Columns純化回收并用顯微注射緩沖液稀釋到100ng/μL，-80℃保存備用。

1.6 TALENs顯微注射及活性驗證

將WFDC2的TALEN-L和 TALEN-R mRNA混合在一起后在顯微鏡（Nikon）下利用顯微操作系統（Eppendorf）注射到15枚 C57BL/6 J的受精卵中，培養3.5 d后挑選出存活的囊胚，混合一起用裂解液裂解，以裂解液為模板，以上游引物：5'-TGTGCTTCCTACCCGCCTCCT-3'和下游引物：5'-CCCGCTCCTCTTCATCAGGTCTC-3'進行PCR擴增，并采用T7E1進行酶切鑒定，其中擴增片段大小為413 bp，酶切片段為120 bp+293 bp。驗證 TALENs有切割活性后，按照上述方法，獲得顯微注射受精卵，將其移植到ICR代孕雌鼠輸卵管內。

1.7 突變檢測及基因型分析

取1周齡小鼠腳趾提取基因組DNA，同時進行編號，按照酶切鑒定方法對F0代小鼠進行基因型鑒定，并將T7E1酶切鑒定為陽性的小鼠的PCR擴增產物連接到T載體上，進行測序和突變基因分析。將Wfdc2基因發生移碼突變的F0代小鼠單獨建系，最后得到Wfdc2純合雙敲除小鼠。1

.8 WFDC2敲除小鼠表型分析

對WFDC2敲除小鼠的出生情況進行觀察分析，記錄每一窩的出生胎鼠數量，基因型比例以及存活情況。

2 結果

2.1 TALEN載體構建

小鼠Wfdc2基因有五個已知轉錄變異體，為了高效敲除WFDC2蛋白表達，本研究選擇的敲除位點為 Wfdc2基因的第一個外顯子區域，如圖 1。TAL-effector識別模塊 HD、NG、NI、NN分別識別堿基C、T、A、G，因此本研究中識別 Wfdc2的模塊序列分別為5'-NN HD NIHD HD NING NN HD HD NG NN HD HD NG NN-3'和TALEN-R 5'-NINN NN NI NN NN HD HD NINN HD NN NN HD HD NI-3'。采用Golden gate的方法[24]獲得了 TALENs體外轉錄模板，如圖2。

2.2 WFDC2敲除小鼠構建及鑒定

圖1 Wfdc2基因敲除TALENs位點Fig.1 The TALENs binding site in the m ouse Wfdc2 gene

圖2 Wfdc2 TALENs識別臂的構建Fig.2 The construction of Wfdc2 TALENs tem p late

體外轉錄分別得到 TALEN-L和TALEN-R的mRNA。將mRNA分別稀釋到100ng/μL后等量混合進行胞質注射，先注射15枚受精卵，進行TALENs活性驗證（圖3），驗證TALENs有切割活性后，共注射140枚受精卵，移植131枚到5只ICR代孕雌鼠輸卵管中，共出生24只小鼠。對出生的24只F0代小鼠進行鑒定，鑒定結果顯示，有9只敲除陽性小鼠（圖4），選取第24號 F0代陽性小鼠繼續繁育最終獲得敲除17個堿基的Wfdc2純合雙敲除模型。

2.3 WFDC2敲除小鼠的表型分析

得到24號F0代陽性小鼠后，我們將它與野生型小鼠交配，F1代留下敲除17個堿基的雜合WFDC2敲除小鼠（WFDC2+/-），這些雜合小鼠能正常生長，和野生型小鼠生長情況并無明顯的差別，WFDC2+/-小鼠自交，能正常懷孕產仔得到F2代小鼠，根據孟德爾第一定律，F2代小鼠中將出現野生型（WFDC2+/+），雜合（WFDC2+/-）及純合（WFDC2-/-）小鼠，并且 WFDC2+/+∶WFDC2+/-∶WFDC2-/-的比例應為1∶2∶1。但是在 F2代小鼠出生后5 d我們對F2代小鼠編號及基因型鑒定時發現，存活的F2代小鼠中沒有發現WFDC2-/-小鼠，只發現 WFDC2+/+和 WFDC2+/-。這一結果說明WFDC2-/-小鼠可能胚胎致死或者出生后死亡。

圖4 鑒定Wfdc2基因發生切割的小鼠Fig.4 Restriction digest of PCR p roducts used for identification of m ice carrying-induced m utations of the Wfdc2 gene

為驗證 WFDC2-/-小鼠是否胚胎致死，我們對7只胚胎 18.5 d（E18.5）WFDC2+/-孕鼠進行剖腹產，發現E18.5 d孕鼠腹中胎兒中有 WFDC2-/-小鼠，并且未見死胎，其中野生型占總出生數量的29.58%，WFDC2+/-占 46.48%，WFDC2-/-占23.94%（表1），接近孟德爾第一定律1∶2∶1的比例。這一結果提示，WFDC2-/-小鼠可能在出生后死亡，經過仔細觀察追蹤，我們發現，每窩新生胎兒中，都有一些新生小鼠尸體或殘骸，懷疑有的可能被母鼠吃掉。接著，我們對這些尸體或殘骸進行基因型鑒定，發現這些死去的胎鼠是WFDC2-/-小鼠。為了防止母鼠將新生 WFDC2-/-小鼠吃掉，我們將剛出生的胎鼠立即與母鼠分開，對不同 WFDC2+/-自交所產生6窩新生小鼠出生情況進行統計，其中50%的新生WFDC2-/-小鼠在5 h之內死亡，所有新生WFDC2-/-小鼠在18 h內死亡，而 WFDC2+/-小鼠和WFDC2+/+小鼠能正常存活下來（圖5）；在這些胎鼠中，WFDC2+/+占總出生數量的 23%，WFDC2+/-占 52%，WFDC2-/-占 25%（表 2），接近孟德爾第一定律；而 WFDC2+/-自交后代每窩平均產仔數和WFDC2+/+自交后代每窩平均產仔數之間沒有顯著差異（圖 6）。上述結果說明非純合WFDC2敲除小鼠和野生型小鼠一樣具有正常的生長發育和生殖繁育能力，而純合 WFDC2敲除小鼠能夠正常出生，并在出生后死亡。

圖5 新生小鼠24 h內生存曲線Fig.5 Survival curve for WT、hetero and KO fetus after birth w ithin 24 hours

表1 E18.5天胎鼠基因型分布情況Tab le 1 Genotype distribution of em bryos from E18.5

表2 新生小鼠基因型分布Tab le 2 Genotype distribution of neonatal from P0

圖6 WFDC2+/-自交后代每窩平均產仔數和WFDC2+/+自交后代每窩平均產仔數Fig.6 Summ ary of litter sizes born from WFDC2+/+and WFDC2+/-

3 討論

現今基因組編輯技術突飛猛進，在TALEN基因編輯技術之后，又出現了CRISPER-Cas9基因編輯技術，因其操作周期短，效率高而被廣泛使用[23，25]。而TALEN也因其相對操作簡單，特異性高等特點，仍被廣泛應用于動植物等的基因編輯。本研究通過胞質注射TALEN mRNA的方法獲得了Wfdc2基因發生移碼突變的F0代小鼠，將該種小鼠單獨建系，繁育和培養，最后獲得純合的WFDC2敲除模型小鼠。

現今有關WFDC2功能的研究，特別是它在腫瘤發生過程中所起作用的研究越來越受人重視。許多研究都指出卵巢癌，肺癌等組織中HE4有異常高表達，并提出 HE4可以作為這些癌癥的檢測指示物。但HE4的高表達是促進癌癥的發生還是由于癌癥的發生而導致HE4的高表達這個問題仍然沒有定論。在目前的研究更傾向于HE4高表達促進癌癥的發生。Zhu等[16]通過沉默卵巢癌細胞中HE4的表達，發現這些癌細胞的增殖及遷移能力隨HE4的減少而降低，指出HE4的表達可能是維持腫瘤細胞增殖、遷移的因子，并且Moore等[17]通過在卵巢癌細胞中高表達HE4，證明HE4促進卵巢腫瘤的發生。但是 Gao等[26]和 Kong等[27]卻指出 HE4在腫瘤中起著抑制癌細胞增殖和遷移的作用。因此現階段關于HE4是否促進腫瘤的發生的結論還需要更多的研究來證實。WFDC2除了在腫瘤組織中有高表達外，它在正常組織中也有表達。在人體正常組織中表達量從高到低的器官依次是氣管，唾液腺，肺；而在小鼠正常組織中表達量從高到低的器官依次是肺，腎等[4]器官，這些研究結果提示HE4可能參與調控體內相關正常生理活動。

本研究發現WFDC2純合敲除小鼠出生后死亡，而非純合WFDC2敲除小鼠能正常生長和繁育。可能的原因是：1）.純合WFDC2敲除小鼠在孕鼠母體內能夠獲得來自母體血液的WFDC2，而出生后由于缺乏母體和自身合成的WFDC2而死亡。而非純合小鼠由于未全部失去自身合成WFDC2的能力而能在出生后正常存活并生長發育。有趣的是，WFDC2在一些物種中高度保守[3]，成熟WFDC2蛋白分子量在13kD，在被糖基化修飾后為27kD左右，至于27kD的WFDC2是否能透過胎盤屏障而到達胎兒體內還有待實驗驗證。2）.WFDC2表達可能具有時空性，在胚胎發育期或胚胎發育早期，WFDC2不參與相關生理活動，在小鼠出生后 WFDC2參與并維持正常生理活動，而純合敲除小鼠由于缺乏WFDC2表達而不能實現相關生理功能正常進行，最終導致死亡。本實驗首次通過實驗證明WFDC2參與調控小鼠正常生理活動，提示 WFDC2可能在維持胎兒正常生理功能中起著重要的作用，同時，通過研究HE4正常生理功能的作用機制，能更好的幫助我們理解它們在癌癥發生中所起的作用。因此，本研究獲得的WFDC2敲除小鼠是研究WFDC2生理功能的良好模型。