銀杏內酯B對心肌缺血/再灌注損傷大鼠能量代謝的影響

周春霞 李 霞 樹俊蓮 徐 麗

（1.原武警總醫院中西醫結合理療科，北京 100039）（2.原武警總醫院藥劑科，北京 100039）

銀杏內酯 B（ginkgolide B，GB）是中藥銀杏葉的活性成分，具有抗過敏、抗炎、抗移植排斥反應及神經保護等多種生物學活性[1-2]。近年來研究發現，GB對實驗動物的心肌損傷具有保護作用[3-4]，然機制未明。本研究擬應用心肌缺血/再灌注（myocardial ischem ia/reperfusion）損傷大鼠模型，探討GB保護心肌的作用機制是否與能量代謝有關。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

GB（純度≥90%）購自 Sigma公司，實驗前用0.9%氯化鈉注射液配制成濃度0.08%、0.04%和0.02%，即給藥劑量 8 mg/kg體質量、4 mg/kg、2 mg/kg。肌酸激酶（CK）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、氯化硝基四氮唑藍（NBT）、ATP酶試劑盒、考馬斯亮藍試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物

SD大鼠50只，雌雄各半，體質量200～240 g，購自河北醫科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（冀）2008-1-003。本研究通過本院動物實驗倫理委員會批準并在其監督下進行。

1.3 方法

1.3.1 建立心肌缺血/再灌注大鼠模型：采用冠脈結扎術，參照文獻[5]方法進行。簡言之，將麻醉后的大鼠仰位固定，四肢連接十二導聯心電圖機（日本光電工業株式會社產品，型號 ECG-1350P）。頸部做氣管插管，連接小動物人工呼吸機（安徽正華生物儀器設備有限公司，型號DW-3000），設呼吸頻率每分鐘60次，潮氣量20 mL/kg。于胸骨左旁第3肋和第4肋間開胸，用絲線撐開肋骨，暴露心臟，沿左心耳下緣冠脈前降支起始部約4 mm處用帶線縫合針進針，深度控制在約 1 mm，將一小段直徑1.5 mm的乳膠管置于縫合線下，之后結扎縫合線致大鼠心肌缺血。缺血30 min左右觀察到心電圖ST段明顯抬高或T波高聳后，松開縫合線再灌注2 h（觀察到心電圖抬高的ST段下降1/2以上或高聳的T波下降，視為再灌注成功）。

1.3.2 分組與給藥：將大鼠隨機分為：假手術組、模型組、GB高劑量組、中劑量組、低劑量組，各組于術前1 h和再灌注即刻分別尾靜脈注射給予1/2量的藥物，假手術組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉注射液。假手術組10只大鼠僅開胸不結扎冠脈，其他各組則每組均抽取術后成模大鼠10只進行后續試驗。

1.3.3 測定血清心肌酶活性：再灌注結束后，動物經腹主動脈采血，常規2 500 r/m in離心10 min分離血清，采用比色法分別于紫外/可見分光光度計（日本島津公司，型號 UV-2550）660 nm和440 nm下測定A值，并計算 CK、LDH活性，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3.4 測定心肌ATP酶活力：采血后，各組取部分心臟，生理鹽水洗凈血跡，用組織勻漿機（德國IKA集團，型號T10）制成勻漿，3 500 r/min離心10 min得上清。采用定磷法于紫外/可見分光光度計660 nm下測定A值，并計算ATP酶活力；心肌勻漿上清液的蛋白濃度采用考馬斯亮藍法定量，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3.5 測定心肌梗死面積（MIS）：各組取心臟，用生理鹽水洗后，去除血管、脂肪及心房組織，從冠脈結扎線下方至心尖處將心室平行切成厚度相等的5片，置于0.1%NBT溶液中，37℃染色15 min。以數碼相機采集圖像（正常心肌呈藍色，梗死心肌則呈灰白色），采用ImagePro Plus 7.0軟件測算心室總面積和梗死區面積，并計算 MIS（%）[6]。

1.4 統計方法

采用SPSS 18.0軟件處理數據，結果以均數 ±標準差（±s±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t檢驗，P＜0.05定為檢驗顯著性水平。

2 結果

2.1 各組M IS情況

模型組動物MIS達20.12%，GB預處理可不同程度地縮小 MIS，其中高劑量組的 MIS縮小至16.20%，與模型組比較差異有統計學意義（F=45.75，P＜0.05）。假手術組因未出現心肌梗死，MIS未納入統計學比較（圖1）。

圖 1 各組 M IS比較（±s ±s，n=10）Fig.1 The com parison of m yocardial in farction size（±s±s，n=10）

2.2 各組心肌酶活性情況

假手術組動物血清CK、LDH活性分別為0.26、1.03 U/m L；與假手術組比較，模型組動物血清 CK活性顯著升高為 0.77 U/mL（t=16.38，P＜0.01），血清LDH活性顯著升高為2.99 U/m L（t=10.98，P＜0.01）；GB預處理可不同程度地降低血清CK和LDH活性，低、中、高劑量組 CK活性分別為0.69、0.64、0.63 U/mL，與模型組比較差異均有統計學意義（F=6.22，P＜0.05或 P＜0.01）；高劑量組 LDH活性為2.20 U/m L，與模型組比較差異有統計學意義（F=2.47，P＜0.01）（圖 2）。

圖2 各組血清 CK和 LDH活性比較（±s±s，n=10）Fig.2 The com parison of CK and LDH activities in serum （±s ±s， n=10）

2.3 各組ATP酶活力情況

假手術組動物心肌組織Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力分別為 4.06、5.75 mmol Pi/g。模型組動物心肌組織Na+/K+-ATP酶活力顯著降低為3.09 mmol Pi/g，與假手術組比較差異有統計學意義（t=2.99，P＜0.01），Ca2+/Mg2+-ATP酶活力顯著降低為3.97 mmol Pi/g，與假手術組比較差異有統計學意義（t=4.58，P＜0.01）；GB預處理可不同程度地影響ATP酶活力，與模型組比較，高、中劑量組可顯著升高 Na+/K+-ATP酶活力為3.69、3.78 mmol Pi/g（F=2.16，P＜0.05），高、中、低劑量組可顯著升高Ca2+/Mg2+-ATP酶活力為4.50、4.79、4.81 mmol Pi/g（F=2.84，P＜0.05 或P＜0.01）（圖 3）。

圖3 各組心肌組織ATP酶活力比較（±s±s，n=10）Fig.3 The com parison of ATPase activities in m yocard ial tissue（±s ±s，n=10）

3 討論

采用藥物預處理的方式可促使機體釋放生物活性物質或直接激活機體自身保護機制，進而增強心肌缺血/再灌注損傷心肌組織對缺血、缺氧的耐受，實現心肌保護作用[7]。本研究觀察了GB預處理對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用，結果顯示GB通過預處理給藥能顯著縮小心肌梗死面積（P＜0.05），這與白志超等[8]的報道結果一致。

當心肌缺血/再灌注發生導致心肌細胞膜受損時，心肌細胞中的蛋白酶CK和LDH外漏增加，其釋放入血的量與心肌壞死程度呈正相關[9]。本研究結果顯示，模型組動物血清CK和LDH活性顯著升高，反映出心肌缺血/再灌注心肌細胞損傷的程度；GB預處理可顯著降低血清CK和LDH活性，提示GB可通過提高細胞膜的穩定性而保護受損的心肌組織。

能量代謝是心肌細胞活動的物質基礎，目前認為能量代謝障礙是心肌缺血/再灌注損傷的始動環節和損傷進一步加重的原因之一[10]，ATP酶活力則可反映細胞的能量水平，在缺血性心臟病的研究中受到重視。心肌缺血/再灌注發生時，線粒體受損，ATP生成減少，使心肌細胞膜和肌漿網上Na+/K+-ATP酶活力降低，導致心肌細胞內Na+濃度升高和酸中毒，通過 Na+-H+交換使細胞內 Na+進一步增多，Na+超負荷會激活細胞膜上的Na+-Ca2+交換蛋白，使 Ca2+內流增多；同時肌漿網上 Ca2+/Mg2+-ATP酶活力降低，胞內Ca2+攝取減少造成細胞內外Ca2+和Mg2+分布失衡，更加重了細胞內鈣超載[11]。鈣超載則會觸發一系列的細胞損傷機制如加重線粒體損傷進而加重心肌細胞的能量缺乏，激活磷脂酶使細胞膜結構受損，激活蛋白水解酶進而引起遲發性細胞死亡等[12]。本研究結果顯示，心肌缺血30 m in再灌注2 h后，心肌組織中 Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力顯著降低，說明此時心肌出現能量代謝障礙，細胞功能受抑；GB預處理則可明顯提高心肌組織中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力，進而調節細胞內外離子平衡尤其是Ca2+穩態，改善心肌組織的能量代謝障礙。

綜上，GB預處理對心肌缺血/再灌注損傷的心肌保護作用是通過保護細胞膜ATP酶活力、改善能量代謝等途徑實現的；至于GB具體作用于能量代謝的哪個環節，尚需進一步研究。