維生素E和/或檸檬酸添加劑對軍曹魚稚幼魚ACO和PPARα基因、抗氧化酶活力和多不飽和脂肪酸代謝的影響

■丁兆坤 黃金華 李偉峰 許友卿

（廣西大學水產科學研究所廣西高校水生生物健康養殖和營養調控重點實驗室，廣西南寧530004）

軍曹魚是一種生長快、養殖發展迅猛的優良海水魚[1-4]。然而，為了開發適宜的人工配合飼料，還需要進一步研究軍曹魚的營養生理學[5-8]。

維生素E是軍曹魚和其他魚類必不可少的微量營養物質[9-10]，具有重要的生理生化功能[11-14]。日糧添加維生素E還可以防止魚體發生脂質過氧化反應，維護魚體氧化穩定性，降低魚的氧化應激，提高魚的免疫力和抗病力，促進魚生長性能和存活率[15-18]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)是機體內調控脂質代謝和基因表達的一種基因[19-20]。維生素E是PPARα的一種激動劑，對PPARα的表達有重要影響[7，21-22]。

檸檬酸(CA)能夠提高魚[23-27]和蝦[28]的生長性能、飼料利用率和存活率。檸檬酸是一種有機酸，具有多種營養生理功能，是一種環境友好型的飼料添加劑[28-30]。檸檬酸是一種優秀的抗氧化劑，能夠有效清除體內外超氧離子和脂質過氧化物，減輕動物的氧化應激[31-32]。檸檬酸也是一種優秀的抗氧化協同劑，能夠有效促進抗氧化酶的活力[32-33]。檸檬酸可以通過檸檬酸循環促進機體代謝和順烏頭酸酶(ACO)基因的表達[34]。順烏頭酸酶(ACO)是機體內檸檬酸循環中催化檸檬酸和異檸檬酸相互轉化的關鍵酶[34]。

在日糧中聯合添加維生素E和檸檬酸可能對動物的生理生化過程起協同作用[33]。然而，日糧中聯合添加維生素E和檸檬酸對軍曹魚稚幼魚的影響還未見報道。本文研究不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑對軍曹魚稚幼魚主要組織/器官的ACO和PPARα基因表達、抗氧化酶活力和多不飽和脂肪酸代謝的影響，同時討論其機制，為開發適合軍曹魚稚幼魚配合飼料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要飼料原料

維生素E購于美國Sigma-Aldrich公司，是從植物油中提取而得的(±)-α-生育酚，V型，1 000 IU/g(Sigma T3634)。北太平洋白魚粉(蛋白質＞65%)和魚油，購于美國海鮮公司。其他原料均是人類食品級，購于國內不同生物技術公司。

1.2 實驗魚的馴化和養殖

從湛江流沙海水魚種苗場購進2 000尾軍曹魚稚魚，魚齡為22 d，體重約2.5 g，體長約3.68 cm。先按照Ding等[7]的方法在廣西防城港市北部灣海濱室內海水養殖系統馴化2周。馴化結束后，挑選大小一致，體長(8.02±0.32)cm、體重(7.32±0.26)g的健壯稚魚420尾隨機分成7組，每組3個平行，共21桶(每桶容積為400 L)，每桶20尾魚，用與馴化相同的養殖系統和海水(過濾、充氣的海水，水溫26.0～32.0℃，鹽度27～30 g/l，pH值7.8～8.0，溶氧量≥6 mg/l)養殖。按照Ding等[7]方法飼養和處理魚。每天定時在8:00和17:00投喂兩次，分別用7種(組)飼料投喂魚。這7種(組)飼料分別是：對照組(D0)，只含基礎飼料，不添加VE和CA；實驗飼料D1～D6組，在每千克干的基礎飼料中分別添加VE 100、0、100、75、50、25 IU和CA 0、12、12、6、3、1.5 g(見表1)。

基礎飼料是在我們前期的試驗[3-4，7]基礎上設計的，如表1所示，由白魚粉、豆粕、酪蛋白、大豆磷脂、魚油、混合維生素(不含VE)、混合礦物質和α-淀粉組成，其蛋白質和脂肪的含量分別約為47%和11%。維生素E的添加量參考了其他學者的研究結果和我們的前期試驗[4，7，9-10，17，35]。據報道，維生素 E(α-tocopherol或者DL-all-rac-α-tocopherol)在對照組日糧中的含量為25.70 IU/kg干飼料(1.1 IU DL-all-rac-α-tocopherol相等于1 mg)[36]，已經基本滿足軍曹魚稚幼魚生存的需求，因為普通養魚的VE需求在6.25～200.0 mg生育酚乙酸酯/kg干飼料(1 IU生育酚乙酸酯相等于1 mg)[36]范圍之內[9-10]。檸檬酸的添加量參考了Sarker等[37]的研究，他們稱在以部分植物蛋白質為蛋白源的魚類日糧中，高效的檸檬酸添加水平應不超過10.0 g/kg干飼料。

表1 實驗飼料的基礎成分及營養水平

這個實驗設計參考了 Cheng等[38]、Pohlenz等[39]和Ding等[7]的方法，設計不僅考察了單獨添加VE(D1組)或CA(D2組)對軍曹魚稚幼魚的影響，又考察了聯合添加VE和CA(D3～D6組)對魚的影響。

按照Ding等[7]方法，采用丸狀日糧投喂魚，即按照表1的飼料成分、數量、比例和分組進行，在室溫下制成丸狀日糧，在60℃下烘干，于4℃冰箱中密封保存備用。在投喂之前，取出在室溫下解凍待用。日總投喂量約為當時魚體濕重的5%并要求達到明顯的飽感。實驗歷時12周。

1.3 取樣和化學分析

于第12周末，每個養殖桶隨機取6尾魚解剖取組織/器官樣品。取樣前，魚禁食24 h。按照Ding等[7]的方法采樣和保存所取得的魚肝、肌肉、腦、心臟、腎和血清樣品。

按Xu等[40]的方法，用氣相色譜儀(GC，Agilent 6890 N，Agilent Company，USA)測定魚組織/器官中的脂肪酸含量。分別按照McCord等[41]、Aebi[42]和Noguchi等[43]的方法，測定魚組織/器官中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活力。用南京建成生物公司生產的谷胱甘肽-S轉移酶(GST)試劑盒，按照使用說明書，測定魚組織/器官中的GST活力。

分別按照Peng等[16]和Weikle[44]的方法，用高效液相色譜儀(HPLC，Agilent 1200，Agilent Company，USA)測定飼料中VE和CA含量。

用德國產梅特勒pH計測定飼料pH值。采用AOAC(1995)[45]標準方法測定飼料中的粗蛋白質、粗脂肪、灰分和水分含量。

1.4 魚組織器官中順烏頭酸酶(ACO)基因序列的測定

軍曹魚的ACO基因序列還未見報道。我們從NCBI（the National Center for Biotechnology Informa-tion)數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索到從斑馬魚(Danio rerio)克隆獲得的ACO基因的保守序列(NM_198908)，以其作為模板合成軍曹魚稚幼魚的首條cDNA。選擇特定正向引物5′CTAGTGCTGGGGCTAAATATGG 3′和 反 向 引 物 5′TGACATTGGGACACTTCAACTC 3′來擴增cDNA片段。按Ding等[7]的方法，測定軍曹魚ACO基因序列。

1.5 ACO mRNAs和 PPARα mRNAs的表達

分別用合成的ACO和PPARα基因首條cDNA為模板，進行實時定量PCR測定。按照上述ACO基因測序所描述的克隆軍曹魚cDNA的方法，設計ACO基因的正向引物和反向引物。

根據已公布的軍曹魚cDNA(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)來設計PPARα基因的正向引物和反向引物。分別為ACO和PPARα設計β-肌動蛋白(EU266539)的引物(見表2)。按Ding等[7]的方法進行ACO或者PPARα基因的RTQ-PCR測定。用2-ΔΔCT法計算ACO和PPARα mRNA的相對表達量[46]。

表2 ACO、PPARα和β-actin基因的RTQ-PCR引物

1.6 統計分析

實驗數據用“平均值±標準誤”表示，用統計軟件SPSS18.0對數據進行方差分析，差異顯著時采用Duncan′s法進行多重比較，當P＜0.05時，為差異顯著。

2 結果

2.1 軍曹魚稚幼魚的ACO基因序列

以斑馬魚ACO基因的保守序列為模板，合成軍曹魚ACO基因的部分DNA保守序列是219 bp。該序列如表3所示，未提交到GenBank基因庫。用NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information's Basic Local Alignment Search Tool)，把軍曹魚ACO基因的部分DNA保守序列與斑馬魚(Danio rerio)(NM 198908.1)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)(XM 003438531.1)的序列比較，發現軍曹魚ACO基因的部分DNA保守序列與斑馬魚(Danio rerio)(NM 198908.1)和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)(XM 003438531.1)的序列相似性分別是86%和90%。

表3 軍曹魚ACO基因部分DNA的保守序列

2.2 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚ACO mRNAs相對表達量的影響(見圖1)

用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，魚肝、肌肉、心臟、腦和腎ACO mRNAs相對表達量分別顯著高于對照組(D0)(P＜0.05)。投喂聯合添加VE和CA日糧的魚(D3～D6組)肝、肌肉、心臟、腦和腎ACO mRNAs的相對表達量，分別顯著高于投喂單獨添加VE(D1組)或CA(D2組)日糧的魚相應組織/器官ACO mRNAs的相對表達量(P＜0.05)。其中D5組魚肝、肌肉、心臟、腦和腎ACO mRNAs的相對表達量最高，分別顯著高于其他組魚ACO mRNAs的表達量(P＜0.05)。

2.3 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚PPARα mRNAs相對表達量的影響（見圖2）

用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，魚肝、肌肉、心臟、腦和腎PPARα mRNAs的相對表達量分別顯著高于對照組(D0)(P＜0.05)。投喂聯合添加VE和CA日糧的魚(D3～D6組)肝、肌肉、心臟、腦和腎PPARα mRNAs的相對表達量，分別顯著高于投喂單獨添加VE(D1組)或CA(D2組)日糧的魚相應組織/器官PPARα mRNAs的相對表達量(P＜0.05)。其中D5組魚肝、肌肉、心臟、腦和腎PPARα mRNAs的相對表達量最高，分別顯著高于其他組魚PPARα mRNAs的表達量(P＜0.05)。

圖1 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚ACO mRNAs表達量的影響

圖2 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚PPARα mRNAs表達量的影響

2.4 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚SOD、CAT、GPx和GST活力的影響(見表4)

由表4可知，用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，魚肝、肌肉、心臟、腦和腎SOD、CAT、GPx和GST活力分別顯著高于對照組(D0)(P＜0.05)。投喂聯合添加VE和CA日糧的魚(D3～D6組)肝、肌肉、心臟、腦和腎SOD、CAT、GPx和GST活力，分別顯著高于投喂單獨添加VE(D1組)或CA(D2組)日糧的魚相應組織/器官的抗氧化酶活力(P＜0.05)。其中D5組魚肝、肌肉、心臟、腦和腎SOD、CAT、GPx和GST的活力最高，分別顯著高于其他組魚相應組織/器官的抗氧化酶活力(P＜0.05)。

表4 不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚肝、肌肉、心臟、腦、腎和血清的SOD、CAT、GPx和GST(U/mg prot.，但血清為U/ml)活力的影響

用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，魚血清SOD、CAT、GPx和GST的活力分別顯著高于對照組（D0）(P＜0.05)。投喂聯合添加VE和CA日糧的魚(D3～D6組)血清CAT和GST的活力，分別顯著高于投喂單獨添加VE(D1組)或CA(D2組)日糧的魚的血清CAT和GST活力(P＜0.05)。然而，血清SOD、CAT、GPx和 GST的最高活力不同于肝、肌肉、心臟、腦和腎的結果。D5組魚血清SOD活力最高，顯著高于其他組魚血清SOD活力(P＜0.05)。D4組魚血清CAT活力最高，顯著高于其他組魚血清CAT活力(P＜0.05)。D6組魚血清GPx活力最高，顯著高于D0、D1～D4組魚血清GPx活力(P＜0.05)。D4組魚的血清GST活力最高，顯著高于D0、D1～D3組和D6組魚血清GST活力(P＜0.05)。

2.5 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚脂肪酸含量的影響（見表5～表10）

用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，顯著影響其多不飽和脂肪酸代謝，魚肝、肌肉、心臟、腦和腎PUFAs和n-3 HUFAs分別顯著高于對照組(D0)(P＜0.05)。投喂聯合添加VE和CA日糧的魚(D3～D6組)肝、肌肉、心臟、腦和腎PUFAs和n-3 HUFAs，分別顯著高于投喂單獨添加VE（D1組）或CA(D2組)日糧的魚相應組織/器官的PUFAs和n-3 HUFAs(P＜0.05)。其中D5組的魚肝、肌肉、心臟、腦和腎PUFAs和n-3 HUFAs最高，分別顯著高于其他組魚相應組織/器官的PUFAs和n-3 HUFAs(P＜0.05)。

不同劑量VE和/或CA添加劑對魚血清中的脂肪酸代謝的影響不同于對魚肝、肌肉、心臟、腦和腎脂肪酸代謝的影響。D4組魚血清的PUFAs和n-3 HUFAs含量最高，顯著高于D0、D1～D3、D5組和D6組魚血清的PUFAs和n-3 HUFAs含量(P＜0.05)。

3 討論

與單獨添加VE(D1組)或CA(D2組)或對照組(D0)比較，用聯合添加VE和CA(D3～D6組)的日糧投喂軍曹魚稚幼魚12周，顯著提高魚肝、肌肉、心臟、腦和腎ACO和PPARα基因的表達量、SOD、CAT、GPx和GST活力以及PUFAs和n-3 HUFAs的含量。這些結果表明，添加在日糧中的VE和CA能協同作用，顯著提高軍曹魚稚幼魚ACO和PPARα基因表達、抗氧化酶活力以及PUFAs和n-3 HUFAs的含量。VE和CA協同作用的原理可能是：①VE和CA能夠協同調節某些基因的表達、提高抗氧化酶的活力。研究表明，VE是PPARα基因的激活劑，能夠促進PPARα基因的表達[7，21-22]。VE 能夠顯著提高魚體中的抗氧化酶活力[7，17，47-48]。而

CA給VE提供了一個適宜的酸性環境，促進VE發揮更好的作用。②VE通過激活脂肪丙烯醛基去飽和并延長之，促進PUFAs合成，同時保護PUFAs免受過氧化。有研究報道，飼料添加VE可顯著提高魚肝和肌肉PUFAs含量而顯著降低SFAs含量[49-50]。③VE和CA都是高效抗氧化劑，它們通過分解和消除軍曹魚代謝過程中產生的活性氧自由基，來協同保護和促進軍曹魚的生理生化過程。VE和CA都能夠通過有效地清除超氧陰離子(·O2-)來協同抑制和切斷脂質過氧化反應[51-53]。VE提供H原子給脂質過氧物自由基(LOO·)生成脂質過氧化物LOOH，以切斷脂質過氧化自由基鏈式反應[51]。脂質過氧化物LOOH是一種氧化性非常強的物質，在有金屬離子中介的情況下，進一步分解為自由基LOO·、LO·和·OH[33]，而VE不能進一步清除LOOH，必須由其他抗氧化劑來清除LOOH[51]。當日糧同時添加VE和CA時，CA能夠抑制LOOH生成[33]。盡管CA不是主要的抗氧化劑，但是CA是一個良好的抗氧化劑協同劑。VE和CA也可能互相再生來擴增它們的功能[33]。因此，在日糧中聯合添加VE和CA能夠協同提高軍曹魚的ACO和PPARα基因的表達、抗氧化酶活力、PUFAs和n-3 HUFAs含量。

表5 不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚肝臟脂肪酸的影響(%)

表6 不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚肌肉脂肪酸的影響(%)

表7 不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚心臟脂肪酸的影響(%)

表8 不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚腦脂肪酸的影響(%)

表9 不同劑量維生素E和/或檸檬酸投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚腎脂肪酸的影響(%)

表10 不同劑量維生素E和/或檸檬酸投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚血清脂肪酸的影響(%)

盡管D3、D4組和D6組的日糧也聯合添加了VE和CA，但是D5組魚的效果最佳，D5組魚的ACO和PPARα基因表達、抗氧化酶活力，以及PUFAs和n-3 HUFAs含量顯著高于D3、D4組和D6組的魚。這些結果表明：日糧中聯合添加較高或較低的VE和CA的添加量(D3、D4組和D6組)的效果都不理想。因此，在日糧中適宜添加VE和CA是有益的。VE和CA的協同作用是劑量依賴性的，但有一個適宜的范圍。本實驗D5組的VE和CA添加量(VE 50 IU和CA 3 g/kg干飼料)最適宜，因此發揮了最佳的協同作用。以前對羅非魚（Oreochromis niloticus×O.aureus）[54]、鯽魚（Carassius auratusgibelio）[55]和凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[28]等的研究也表明，CA的適宜添加量為2.0～3.0 g/kg干飼料。蔡超等[56]也認為，在魚飼料中添加CA不宜超過0.5%。

與對照組(D0)比較，單獨添加VE(D1組)能夠顯著提高軍曹魚肝、肌肉、心臟、腦和腎ACO和PPARα基因表達量、SOD、CAT、GPx和GST的活力以及PUFAs和n-3 PUFAs的含量。這個結果與Kim等[57]的試驗結果一致，他們在雄性小鼠日糧中添加VE提高了小鼠肝臟中的PPAR-α基因表達量。Zhou等[17]、Lu等[48]和Ding等[7]也報道，日糧中添加VE能夠提高抗氧化酶的活力。這是因為VE能夠降低氧化應激。當活性氧自由基過度累積時，PUFAs和抗氧化酶的活力會受到抑制[58]，而VE能夠有效地清除活性氧自由基[51]。

單獨添加CA(D2組)也能夠顯著提高軍曹魚肝臟、肌肉、心臟、腦和腎ACO和PPARα基因表達量、SOD、CAT、GPx和GST的活力以及PUFAs和n-3 PUFAs的含量。理由可能是：CA能夠提高抗應激能力和抗氧化作用。作為一個高效抗氧化劑，CA能夠有效地清除超氧離子和螯合金屬離子來切斷脂質過氧化物自由基鏈式反應[59-60]，提高抗氧化能力。CA也是一種優秀的抗氧化協同劑，能夠有效促進抗氧化酶的活力[32-33]。Su 等[28]報道，日糧添加CA 2.0～5.0 g/kg干飼料，能夠顯著提高白蝦血清中的SOD活力。

本實驗發現，飼料營養成分顯著影響著軍曹魚肝、肌肉、心臟、腦、腎和血清的生理生化過程。然而，不同劑量VE和/或CA添加劑對軍曹魚血清中的抗氧化酶的活力、PUFAs含量的影響不同于對軍曹魚肝、肌肉、心臟、腦和腎相應參數的影響。原因是：血清是魚體內營養物質不斷發生變化的一種介質，血清酶的含量和功能會隨著許多因素如生理、營養、時間、溫度和其他環境因素的變化而變化[61]，不像肝、肌肉、心臟、腦和腎那樣相當穩定[7]。

4 結論

本研究發現，在本實驗條件下，日糧中添加不同劑量的VE和/或CA添加劑能夠顯著提高軍曹魚稚幼魚的ACO和PPARα基因表達量、抗氧化酶活力、PUFAs和n-3 HUFAs含量。聯合添加VE和CA具有協同作用，顯著高于單獨添加VE(D1組)或CA(D2組)者。最佳添加量是VE 50 IU和CA 3 g/kg干飼料。