基于羧酸酯酶降解伏馬毒素研究

■陳亭亭 張巧艷* 王 坡， 林 琳 楊 華 楊蘭花 楊勝利 袁玉偉

(1.浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江杭州310021；2.浙江工業大學藥學院，浙江杭州310014；3.上海市質量監督檢驗技術研究院，上海200233；4.義烏出入境檢驗檢疫局，浙江義烏322000)

伏馬毒素（Fumonisins，FBs）是由層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、輪狀鐮刀菌（Fusarium verticillioides）等絲狀真菌產生的水溶性代謝產物[1]，分子結構見圖1。與絕大多數真菌毒素不同的是，它缺乏環狀結構，但仍具有很強的毒性[2]。其中，伏馬毒素B1（Fumonisin B1，FB1）污染率最高，占伏馬毒素總量的70%～80%，且危害最大，具有致畸性、致癌性，可誘發人類食管癌、豬肺水腫、馬腦白質軟化等癥[1-3]。豬長期攝入低劑量伏馬毒素污染的飼料還將導致日增重下降和免疫抑制[4]。近年來，調查顯示，玉米、大豆、小麥、DDGS飼料和全價飼料中伏馬毒素是主要的污染物[5]。2014年，我國華東地區抽檢的仔豬配合飼料中伏馬毒素檢出率為83.3%，雛禽、蛋禽配合飼料污染率達100%[6]。為了減少污染危害，美國FDA規定動物飼料中伏馬毒素的限量范圍為5～100 mg/kg[7]。我國即將實施的《GB 13078—2017飼料衛生標準》特別新增了伏馬毒素的限量要求，其中豬飼料中的限量為5 mg/kg，牛飼料中的限量為50 mg/kg[8]。

飼料中伏馬毒素的污染不僅影響畜禽健康養殖，而且將通過食物鏈長期威脅人類健康。高效安全的脫毒方法受到養殖企業、飼料企業以及獸醫專家的廣泛關注。大多數物理和化學脫毒法容易破壞飼料的營養成分，改變適口性，從而影響動物產品的品質和產量；一些處理試劑的殘留蓄積還會帶來二次污染而造成不可估量的安全隱患。生物法脫毒包含微生物法和酶法。酶法因具有專一性強、反應條件溫和、操作簡單、相對安全等特點而廣受青睞，而且酶制劑相對于微生物制劑更容易保存，可直接以飼料添加劑形式用于畜禽生產中。本研究從緩沖體系、反應溫度、酶濃度、底物濃度等方面首次探索了一種羧酸酯酶對FB1的降解規律(見圖1)，旨在為伏馬毒素酶法脫毒的實際應用提供科學指導。

圖1 伏馬毒素B1酶解示意圖

1 材料與方法

1.1 試驗材料

FB1標準品購自青島普瑞邦生物工程有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，購自德國默克公司；其他試劑均為國產分析純。羧酸酯酶：從養殖場附近的土壤中篩選獲得一株革蘭氏陰性細菌，具有伏馬毒素降解活力，經搖瓶發酵、初步純化制得粗酶。

1.2 檢測方法

1.2.1 儀器條件

采用柱前衍生高效液相色譜-熒光法檢測。色譜柱：Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為0.05 mol/l檸檬酸鈉緩沖液（pH值4.0），B相為甲醇；梯度洗脫條件：0～2 min，55%B；2～4 min，55%B～75%B；4～9 min，75%B～90%B；9～9.5 min，90%B；9.5～13 min，90%B～55%B；13～15 min，55%B；流速：1.0 ml/min；激發波長335 nm，發射波長440 nm；進樣量：50 μl；柱溫：35 ℃。

1.2.2 樣品處理

取一定體積的待測液，適當稀釋，與反應液Ⅰ和反應液Ⅱ等體積混合衍生，過膜后檢測。反應液Ⅰ：14 μl β-巰基乙醇溶于 4 ml 0.1 mol/l硼酸鈉緩沖液（pH值9.1）；反應液Ⅱ：稱取10 mg鄰苯二甲醛，溶于1 ml甲醇中，再加入3 ml 0.1 mol/l硼酸鈉緩沖液（pH值9.1），混勻。其中反應液Ⅱ在室溫下可穩定1周[9]。

1.2.3 HFB1制備

取0.5 ml 200 μg/ml FB1甲醇溶液，與10 ml 1 mol/l KOH溶液混合，70℃孵育1 h，冷卻后用2 mol/l HCl溶液將pH值調至4.5。將反應液用HLB柱凈化，獲得濃度為11.2 μg/ml的HFB1甲醇溶液，用作液相分析HFB1含量的參考標樣[10-11]。

1.3 試驗方法

1.3.1 相關定義

酶活定義：在30℃、pH值8.0條件下，每分鐘從10 μg/ml FB1中降解1 μg FB1所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。FB1降解率定義：FB1的降解量與原始添加量之比，用百分比表示。HFB1生成率定義：HFB1的生成量與FB1完全轉化成HFB1的理論值之比，用百分比表示。結果均為3次測定的平均值。

1.3.2 緩沖體系

配制磷酸鉀緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）、Teorell-Stenhagen緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）[12]、Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0），以及系列不同pH值的20 mmol/l Teorell-Stenhagen緩沖液（pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0），分別在2 ml緩沖體系中加入FB1（10 μg/ml）、BSA（0.1 mg/ml）和酶（20 U/l），30 ℃孵育3 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測，比較降解效果。

1.3.3 反應溫度

制備2 ml反應體系[FB110 μg/ml，BSA 0.1 mg/ml，酶20 U/l，Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）]，分別在20、30、40、50、60、70、80 ℃中孵育3 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測，比較降解效果。

1.3.4 酶濃度

在 2 ml反應體系[FB110 μg/ml，BSA 0.1 mg/ml，Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）]中，添加粗酶至終濃度分別為：1、10、20、40、100 U/l，30 ℃孵育0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、16、20、24 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測，比較降解效果。

1.3.5 底物濃度

在2 ml反應體系[BSA 0.1 mg/ml，酶 20 U/l，Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）]中，添加底物FB1至終濃度分別為：1、5、10、20、50、100 μg/ml，30 ℃孵育0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、16、20、24 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測，比較降解效果。

2 結果

2.1 緩沖體系的影響

緩沖鹽和pH值會影響酶、底物的解離程度，從而影響酶分子對底物分子的結合和催化。FB1的酶解在不同的緩沖體系中進行，結果發現，Tris-HCl緩沖液有利于FB1的酶解，3 h的降解率達到47.08%，磷酸鉀緩沖液僅次之，Teorell-Stenhagen緩沖液效果最差（降解僅32.32%）。但由于Teorell-Stenhagen緩沖液具有相對較寬的緩沖范圍（pH值2.0～12.0）[12]，被進一步用于考察酶解反應的最適pH值。由圖2可知，該酶最適反應pH值8.0，此時FB1降解率和HFB1生成率基本達到最高值。整體上看，FB1隨pH值變化的降解規律與HFB1生成規律基本一致，但降解率曲線與生成率曲線不完全重合，推測FB1酶解過程存在中間產物。Heinl等[1]也曾發現FB1的酶解產物除了HFB1外，還存在兩種結構不同的部分水解型伏馬毒素B1（pHFB1）。而且，中間產物在降解產物中的比例可能與緩沖體系的pH值緊密相關，堿性條件相比酸性條件顯然更有利于FB1的完全轉化，可以解釋為：FB1通過羧酸酯酶水解生成HFB1、pHFB1和TCA，TCA能與堿發生中和反應，促進整個反應向生成HFB1的方向進行。另外，當緩沖液的pH值小于3.0或大于11.0時，該酶幾乎無法降解FB1，可能過酸或過堿的條件不適宜酶與FB1的結合、催化，或者此時酶已變性失活。

圖2 反應pH值對伏馬毒素B1酶解的影響

2.2 反應溫度的影響

酶促反應具有溫度依賴性，因為反應溫度會影響分子運動、酶的活力和底物親和力。一方面，升高溫度可以增加酶促反應速度；另一方面，溫度過高會導致酶蛋白變性失活。FB1的酶解在不同的溫度下進行，由圖3可知，最適反應溫度為30℃。涉及的羧酸酯酶具有較寬的溫度適應性，在20～70℃范圍內均有降解活力，高于80℃時，FB1降解率幾乎為零，可能高溫不利于FB1的水解反應或者此時酶已失活。另外，隨反應溫度的變化，FB1降解和HFB1生成具有相似的趨勢，但降解率與生成率不一致，進一步證實中間產物的存在，并推測中間產物的生成量與反應溫度緊密相關。

2.3 酶濃度的影響

通常，當底物分子濃度足夠時，酶分子越多，底物轉化的速度越快。固定底物濃度為10 μg/ml，在最適條件（pH值8.0、30℃）下進行FB1的酶解反應，考察不同酶濃度下的降解規律。由圖4可知，在酶解起始階段，隨著酶濃度的增加，同一時間的降解率增加。計算反應3 h的平均速率，當酶濃度低于40 U/l時，降解速率與酶濃度成正比；當酶濃度為100 U/l時，降解速率增幅較小，可能此時底物分子趨向于被酶分子所飽和。較低的酶濃度（1 U/l）下反應1 d，仍有36.91%的FB1殘留。較高的酶濃度（100 U/l）下反應2 h，FB1的降解率已達到91.70%；反應3 h以后，FB1的降解率和HFB1的生成率趨于100%，顯然此時FB1被完全轉化成HFB1，而HFB1沒有進一步降解為其他產物，說明該酶專一性作用于酯鍵。當酶濃度為20 U/l時，反應8 h就能獲得較好的降解效果，此時FB1殘留僅剩10%左右。進一步觀察發現，在該酶濃度下，反應前期（20 h前），降解率始終大于生成率，說明中間產物的存在；反應后期（20 h后），降解率幾乎等于生成率，推測FB1酶解生成HFB1的反應是不可逆的，隨作用時間的延長，中間產物pHFB1也能被完全水解成HFB1。

圖3 反應溫度對伏馬毒素B1酶解的影響

圖4 酶濃度對伏馬毒素B1酶解的影響

2.4 底物濃度的影響

一般隨底物濃度升高，酶促反應速度先升高后不變。固定酶濃度為20 U/l，在最適條件（pH值8.0、30℃）下進行FB1的酶解反應，考察不同底物濃度下的降解規律。由圖5可知，在酶解過程中，隨著FB1濃度的增加，同一時間的降解率降低，可能過多的底物分子阻礙了酶分子的結合、催化。以圖5數據計算反應3 h的平均速率，繪制底物濃度(S)與降解速度(V)的關系曲線，發現當FB1濃度低于50 μg/ml時，降解速率隨底物濃度的增加而增加，呈正比關系，表現為一級反應；高于50 μg/ml時，降解速率基本保持不變，表現為零級反應，說明此時酶已被底物完全飽和。由米氏方程推出：，繪制1/V-1/S關系曲線，可得：最大降解速率Vmax為0.148 μmol/(l·min)，米氏常數Km為33.2 μmol/l。HFB1的生成規律與FB1的降解規律隨底物濃度變化的相關性趨勢基本一致，但同一時間的生成率幾乎都小于降解率，直至反應1 d時FB1才完全轉化成HFB1，反映了FB1的酶解程度與作用時間緊密相關。反應8 h，濃度低于20 μg/ml的FB1降解率在90%以上；反應20 h，各種濃度的FB1均能被降解。

2.5 實際應用

圖5 底物濃度對伏馬毒素B1酶解的影響

從超市、農貿市場、養殖場、飼料企業獲得25份玉米粉，用李為喜等[13]的方法進行樣品前處理，用柱前衍生高效液相色譜-熒光法檢測，篩選獲得1份FB1含量為18.26 mg/kg的試樣，其液相色譜圖見圖6(B)。取5 g玉米粉試樣，以料液比1∶1.5加入20 mmol/l Tris-HCl緩沖液（pH值8.0）（包含20 U/l酶和0.1 mg/ml BSA），充分混合，在最適條件（pH值8.0、30℃）下靜止反應1 d，FB1仍有35.67%殘留；靜止反應2 d，FB1完全轉化成HFB1[圖6(C)]。假設玉米粉試樣中所有FB1均浸出于緩沖液中，估算底物濃度為12.17 μg/ml。由圖5可知，當 FB1濃度為 10 μg/ml時，反應 8 h，降解率為94.57%；反應20 h，降解率達到100%。推測玉米粉酶解過程中，固體基質的存在嚴重干擾了酶分子與底物分子的作用，從而影響了酶解效率。以后將優化料液比，增加攪拌等措施，使酶分子與底物分子充分接觸，縮短完全降解時間。

圖6 玉米粉伏馬毒素B1酶解前后液相色譜圖

3 討論

DDGS（Distillers'dried grains with solubles）是釀酒酵母發酵玉米等谷物生產酒精的主要副產物，蛋白含量高（約30%～35%），營養價值好（富含氨基酸、維生素、礦物質和多糖），且產量較大、成本較低，近幾年已逐漸成為一種高需求的動物飼料[14]。然而，玉米原料容易被伏馬毒素污染，加上酵母細胞壁和原料中的礦物質會富集真菌毒素（發酵后FB1含量增加1.37～1.94倍），導致DDGS的安全性受到影響[15-16]。在發酵中添加降解毒素的酶制劑，可實現生產過程脫毒。按玉米發酵生產酒精的工藝，一般控制發酵溫度在30℃左右；而大多數酵母在微酸性環境中生長最好，發酵pH值一般控制在5.0左右[17]。本研究涉及的羧酸酯酶在pH值5.0條件下可以降解伏馬毒素，最適酶解溫度為30℃，能夠適應發酵環境。應用羧酸酯酶，聯合其他酶制劑，開發脫毒DDGS產品，有利于提升國產DDGS品質，應對進口貿易壁壘。

BSA（Bovine serum albumin）是一種常用的載體蛋白，由581個氨基酸殘基組成，可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質結合，防止酶的分解和非特異性吸附[18]。Fornasier等[19]報道，BSA可以增加酯酶的提取得率。本研究發現，10 μg/ml FB1在20 U/l酶作用下水解3 h，不添加BSA的降解率僅有添加時的1/3，可見BSA能夠顯著提高羧酸酯酶的催化活力。Palacharla等[20]曾發現BSA具備捕獲脂肪酸的能力。由此推測，其作用機理是：BSA與FB1水解產物TCA結合，從而促進FB1的酶解。此外，聚乙二醇（PEG）、吐溫（Tween）等一些非離子型表面活性劑，在促進酶解方面展現了與BSA相當的效果[21-22]。以后將深入研究這些添加劑的作用機理，并結合不同酶濃度、底物濃度下的降解規律，開發復合型酶制劑和飼料脫毒技術，應用于畜禽養殖生產中。

4 結論

本研究涉及的羧酸酯酶具有較強的pH值和溫度適應性，最適反應pH值為8.0，最適反應溫度為30℃。酶解過程具有時間依賴性，且FB1的降解和HFB1的生成存在不同的規律。較低的酶濃度（1 U/l）下反應1 d，有36.91%的FB1殘留；較高的酶濃度（100 U/l）下反應3 h，FB1能被完全降解。當酶濃度為20 U/l時，在最適條件下進行酶解反應，反應8 h時，濃度低于20 μg/ml的FB1降解率在90%以上；反應20 h時，低、中、高濃度的FB1均被降解。最大降解速率Vmax為0.148 μmol/(l·min)，米氏常數Km為33.2 μmol/l。該酶作用于玉米粉，反應2 d，能將FB1完全轉化成HFB1，應用前景廣闊。