動植物蛋白比恒定的飼料中發酵豆粕對刺參生產性能、消化酶和非特異性免疫的影響

■ 包鵬云 叢玉婷 李曉宇 徐永平

(1.大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧大連116024；2.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連116023；3.動物性食品安全保障技術教育部工程研究中心，遼寧大連116620)

刺參屬于“海產八珍”之一，含有豐富的多糖、皂苷及膠原蛋白等多種生物活性物質和礦物質元素，具有藥食同補功能，對提高人體免疫力，抵抗各種疾病和應激具有非常顯著的功效，頗受廣大消費者的認可，成為最受歡迎的海產品之一。通過最近15年的發展，刺參養殖業已處于平穩發展階段，養殖技術日趨成熟，市場供需處于較為平衡的狀態。2015年，刺參全國總產量達到20.58萬噸[1]，實現產值約300多億元，刺參已經成為我國海水養殖業中單一品種，產值和經濟效益最高的品種。刺參產業已經成為北方沿海地區第一大漁業產業，對于實現漁業增效、漁民增收，促進北方沿海地區新農村建設和漁業產業的發展意義重大。

刺參屬于低等的棘皮動物，是底棲的，腐屑食性，雜食性偏植物性的海洋經濟類養殖動物。其索餌空間狹小，活動距離短，不能像魚、蝦等游泳動物一樣自由活動和選擇最適的生存環境和優質餌料，優質天然餌料的獲取是刺參生長非常重要的限制性因素之一。隨著刺參大規模池塘養殖和海上浮筏網籠養殖的開展，天然餌料已不能滿足刺參規模化養殖的實際需要，人工配合飼料的開發和應用成為刺參營養學和飼料學研究的熱點。

決定刺參健康、生長和產品品質的主要營養成分是飼料中的蛋白質，飼料中所需的動物蛋白源的價格遠高于植物蛋白源的價格，又因刺參的食性決定了其所攝食的配合飼料蛋白質營養濃度較低，動物蛋白源又必不可少，為了控制刺參飼料成本，實現刺參飼料的營養平衡、環保與高效利用，本試驗在前期研究確定飼料中動植物蛋白比為1∶3時，刺參有最佳生長效果的基礎上，進一步研究飼料中發酵豆粕添加量對刺參生產性能和消化酶、免疫酶活性的影響，以期為動植物蛋白源魚粉、發酵豆粕、豆粕等在刺參配合飼料中的合理應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼料配制

刺參配合飼料按等氮等脂原則設計和配制，生產魚粉含量為6.5%，動植物蛋白比為1∶3的6種配合飼料（D0為對照組，D4%、D8%、D12%、D16%、D20%五個試驗組飼料是用發酵豆粕按4%、8%、12%、16%和20%的比例取代日糧中豆粕）。其中以魚粉、大豆粕、發酵豆粕、玉米蛋白粉為動植物蛋白源，以馬尾藻粉和α-淀粉為碳水化合物，以魚油為脂肪源。所有飼料原料用超微粉碎機進行粉碎后95%以上過200目篩網，而后試驗用制粒機制成直徑5 mm的硬顆粒飼料，45℃風干后裝于4℃冰箱保存備用。日糧組成及營養成分見表1。

1.2 動物飼養與管理

試驗刺參，暫養階段的刺參放于室內可控溫的水槽中投喂商品飼料,暫養15 d，溫度控制在(12±1)℃,使之逐漸適應試驗水環境。暫養結束后，試驗刺參饑餓24 h，稱重，挑選個體大小均勻的健康刺參隨機分配到18個水槽(60 cm×40 cm×40 cm)中進行飼養試驗。選取初始體重為(44.47±1.45)g刺參，隨機分為6組，每組3個平行，每個平行組15頭刺參。正式試驗持續40 d。每天投喂飼料為刺參體重的3%，以后根據每天各水槽中刺參的攝食情況進行適當調整投喂量，以1～2 h攝食完為準,每天早晚各投喂1次,吸除殘餌和糞便，每天換新鮮海水三分之一。飼養期間連續充氣，水溫控制在12～15 ℃，鹽度28～32，pH值7.8～8.5，溶解氧高于5 mg/l，氨氮不高于 0.2 mg/l，亞硝氮不高于0.1 mg/l。

1.3 稱重與酶活性的測定

試驗結束后，將刺參饑餓24 h以排空其腸道內的糞便，用干燥的白毛巾吸干體表水分，稱刺參的終末體重；從每個水槽取5頭刺參，用醫用注射器抽取體腔液4～5 ml后，將刺參于冰盤上解剖，用生理鹽水沖洗消化道內容物，然后將生理鹽水與消化道內含物按10∶1混合，并于冰浴下進行勻漿，4℃下10 000 r/min離心15 min，取上清液進行消化酶活性的測定。體腔液也進一步在冰浴中用勻漿器勻漿，以便將各種細胞中的酶釋放出來，在4℃時，12 000 r/min離心20 min，取上清液分裝于離心管中，在-80℃冰箱保存，待測定各項酶指標。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性和總抗氧化能力的測定均采用試劑盒法（南京建成生物工程研究所）測定，操作步驟按說明書進行。

表1 日糧組成及營養水平

1.4 飼料營養成分的測定

試驗飼料和刺參體壁營養成分含量采用概率養分分析方法測定：干物質含量采用烘干法測定，105℃烘干至恒重；粗蛋白質含量采用凱氏定氮法測定；粗脂肪含量采用索氏抽提法測定；粗灰分含量采用高溫灼燒法測定，在550℃灼燒至恒重[2]。

特定生長率(%/d)=100×(lnW2-lnW1)/t增重率(%)=100×(W2-W1)/W1體壁系數(%)=100×FBW/W2

式中：W1——刺參的初始體重（g）；

W2——刺參的末體重（g）；

FBW——刺參的終末體壁重（g）；

t——試驗時間（d）。

1.5 數據處理

采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析(One Way ANOVA),采用Duncan′s法多重比較進行差異顯著性檢驗，P＜0.05為顯著性差異，用不同字母進行標注。

2 結果

表2 飼料中發酵豆粕含量對刺參生產性能的影響

由表2可知，本試驗中對照組刺參增重率、特定生長率和終末體壁重均小于發酵豆粕試驗組，且對照組的刺參增重率、特定生長率和終末體壁重與試驗組D12%、D16%和D20%比較差異顯著(P＜0.05)，而各組間刺參體壁系數差異不顯著。刺參增重率、特定生長率和終末體壁重都是隨著飼料中發酵豆粕含量的升高而先升高后降低，當飼料中發酵豆粕含量提高到16%時，刺參增重率、特定生長率和終末體壁重達到最大值，高于對照組和試驗組。結果表明：當飼料中發酵豆粕含量提高到16%時，本試驗中刺參各項生產性能指標達到最優。

表3飼料中發酵豆粕含量對刺參體壁營養成分的影響(干物質)（%）

由表3可知，與對照組相比，各發酵豆粕試驗組對刺參體壁營養成分(干物質、粗脂肪、粗灰分)無顯著性影響,但各組間刺參體壁營養成分中粗蛋白質含量存在差異。刺參體壁干物質含量在7.80%～8.11%之間；粗蛋白質含量在38.16%～43.17%之間，發酵豆粕16%試驗組刺參粗蛋白質含量最高，豆粕含量20%的對照組刺參粗蛋白質含量最低；粗脂肪含量在4.19%～4.50%之間；粗灰分含量在30.15%～33.85%之間。

表4 飼料中發酵豆粕含量對刺參消化酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，發酵豆粕顯著性影響胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活性(P＜0.05)。試驗組中隨著發酵豆粕含量的提高，胃蛋白酶和胰蛋白酶活性隨之升高，脂肪酶和淀粉酶也有類似的變化趨勢。發酵豆粕含量為20%時，刺參胃蛋白酶、胰蛋白酶活性最高，與發酵豆粕含量16%的試驗組差異不顯著,與其他各組比較差異顯著(P＜0.05)。豆粕含量20%對照組，刺參胃蛋白酶、胰蛋白酶活性最低，與其它各組比較差異顯著。對照組與發酵豆粕4%、8%、12%的試驗組之間脂肪酶活性差異不顯著，但對照組脂肪酶活性顯著性(P＜0.05)低于發酵豆粕含量16%、20%的試驗組，發酵豆粕16%和20%的試驗組間脂肪酶活性差異不顯著。

表5 飼料中發酵豆粕含量對刺參體液關鍵酶活性的影響

由表5可知，本試驗中除堿性磷酸酶外，對照組與發酵豆粕各試驗組之間酸性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力差異顯著（P＜0.05）。隨著發酵豆粕含量的增加堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力都表現出升高的趨勢。除過氧化氫酶外，當發酵豆粕含量達到16%～20%時，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力升高后趨于一致，二者之間差異不顯著（P＞0.05），均顯著高于對照組和發酵豆粕4%試驗組（P＜0.05）。發酵豆粕含量達到20%時，過氧化氫酶活性顯著高于其它各試驗組。豆粕含量20%的對照組的酸性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力顯著低于其它各試驗組。

3 討論

蛋白質是水產動物生長、繁殖的物質基礎，其在刺參營養需要中處于非常重要的地位，飼料中蛋白質的質量影響刺參的攝食、生長、營養物質的消化與吸收等多種生理活動。飼料添加發酵豆粕對改善飼料蛋白質質量有重要作用，可以提供豐富的氨基酸和肽類物質。刺參屬于雜食性偏植物性的海洋動物，飼料中同時添加動物性蛋白源魚粉和植物蛋白源豆粕、發酵豆粕或其它植物餅粕等才能夠實現動植物蛋白源優勢互補，達到飼料氨基酸相對平衡，促進刺參快速生長的目的。很多試驗證明魚粉含量偏低，對刺參生長有抑制作用[3-5]。本試驗中各組飼料中動植物蛋白比為1∶3，魚粉含量為6.5%，但隨著飼料中發酵豆粕含量的升高，魚粉與發酵豆粕的相對比值也呈現下降趨勢（1.63、0.81、0.54、0.41、0.32），發酵豆粕添加量的增加也起到替代魚粉的作用。在本試驗中刺參飼料中發酵豆粕含量對刺參的生長性能有一定的影響，當飼料發酵豆粕含量達到16%時，刺參的特定生長率、增重率、體壁質量達到最大值。沈城等（2015）[6]利用發酵豆粕替代15%魚粉，中華鱉的增重率和特定生長率均提高顯著且達到最大值；楊耐德等（2008）[7]發現凡納濱對蝦養殖實驗中發酵豆粕替代魚粉蛋白超過33.33%，則會降低凡納濱對蝦生長性能和飼料利用率；Lou等（2004）[8]在石斑魚上也發現用發酵豆粕替代魚粉比例超過7.4%可抑制生長。水產養殖動物的種類不同，其所需要的必需氨基酸模型不同，配制的飼料中動植物蛋白源魚粉和發酵豆粕的最佳比例也有很大的差別，特別是發酵豆粕和魚粉的氨基酸組成差異較大。發酵豆粕做為優質植物蛋白源，雖然氨基酸組成相對平衡，但限制性氨基酸蛋氨酸和賴氨酸遠低于魚粉中的含量，這可能是飼料中發酵豆粕添加量過高，魚粉蛋白相對含量降低后容易導致飼料利用率降低，影響刺參、魚蝦等水產動物生長的原因。

刺參的可食部分主要是刺參體壁，其營養和保健功能與體壁的質量密切相關。飼料營養成分對刺參體壁質量有一定影響。本試驗中飼料中發酵豆粕的含量對刺參體壁中粗蛋白質有一定影響，當飼料中發酵豆粕含量達到16%時，對刺參體壁蛋白質的沉積作用達到最大值。對其它常規營養成分（干物質、粗脂肪、粗灰分）影響不顯著。閆磊等（2017）[9]、程成榮等（2004）[10]和Liang等（2017）[11]通過實驗在洛氏鱥、雜交羅非魚和花鱸上證實了類似結果的存在。但是Luo等（2004）[8]、馮建等（2016）[12]、Lee等（2016）[13]和沈城等（2015）[6]研究發現，發酵豆粕替代魚粉對中華鱉稚鱉、石斑魚、大黃魚和許氏平鮋肌肉的粗脂肪、水分、粗蛋白質和粗灰分含量無顯著影響。呂云云等（2016）[14]發現發酵豆粕對圓斑星鰈的體成分（干物質、粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分）的影響顯著(P＜0.05)。導致以上差異存在的原因可能是水產養殖動物種類、發酵豆粕質量、飼料中其它原料（如魚粉、豆粕等）添加量等因素綜合作用的結果。

很多學者開展了發酵豆粕對水產養殖動物消化酶活性影響的相關研究，一般認為適量添加發酵豆粕能夠提高水產動物的消化酶活性，過量添加則有抑制作用[6，15-17]，但對少部分水產養殖動物的蛋白酶的影響不顯著，而對淀粉酶的影響顯著(P＜0.05)[18]。本試驗中發酵豆粕（4%～20%）試驗組與對照組比較蛋白酶和淀粉酶顯著升高，脂肪酶也有升高趨勢，但只有發酵豆粕16%和20%的試驗組脂肪酶顯著性高于對照組。這可能是由于對照組中豆粕含量高，胰蛋白酶抑制因子等抗營養因子較多，抑制消化酶活性，而試驗組中發酵豆粕經過酶解和微生物分解，使各種抗營養因子顯著性降低或完全去除，并且發酵豆粕中氨基酸和肽類物質可做為底物有誘導消化酶分泌和提高消化酶活性的作用。

刺參屬于無脊椎的海洋棘皮動物，不具備脊椎動物所特有的免疫組織和器官，主要通過非特異的細胞免疫和體液免疫完成對病原微生物和其它抗原物質的免疫防御以及完成對體內產生的過氧化物的清除工作，體液免疫反映主要由體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶等多種免疫因子共同決定[19-21]。刺參體腔液中主要免疫或抗氧化酶活性是衡量刺參機體生理狀態的重要指標。本試驗中發酵豆粕試驗組的酸性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力都顯著高于對照組(P＜0.05)，刺參體腔液中的這些酶類在清除機體氧自由基，防止生物分子損傷方面具有重要作用，是刺參非特異性免疫水平的高低的標志。當發酵豆粕替代魚粉量增加到25%以后，酸性磷酸酶、堿性磷酸酯酶、超氧化物歧化酶活性明顯下降，因此使用發酵豆粕時必須保證魚粉的最適使用量，否則會對中華鱉的非特異性免疫產生明顯的影響[22]。彭松等（2015）[23]利用發酵豆粕替代魚粉顯著性的提高凡納濱對蝦超氧化物歧化酶（SOD）活性，類似的試驗結果在許氏平鮋上也被發現。Song等（2014）[24]證實過多添加大豆蛋白水解物降低魚粉在飼料中的含量則會使星斑川鰈的超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力降低。由以上現象可以得出在刺參、魚蝦等飼料中動物蛋白源魚粉適量時，添加一定量的發酵豆粕可提高機體的免疫力和抗氧化能力，但具體機理和途徑，因水產動物的種類不同差異較大，有待進一步深入研究。

4 結論

在動植物蛋白比為1∶3的刺參飼料中，發酵豆粕添加量達到16%時，刺參生長、體壁蛋白質含量達到最佳，消化酶活性、免疫酶活性都得到提高，具有一定的理論研究價值和生產應用價值。