伊馬替尼治療慢性髓系白血病耐藥機制研究進展

徐祥梅 邢宏運 韓麗英

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種造血干細胞克隆增生性疾病，其發病機制以9號和22號染色體的長臂相互易位構成費城染色體為特征，該易位導致BCR-ABL融合基因編碼產生具有高酪氨酸激酶活性腫瘤蛋白，并具有持續酪氨酸激酶活性，通過下游信號途徑促進增生[1]。針對CML的治療，經歷了局部放射、白消安、羥基脲、干擾素等不同時代，到如今的TKI治療時代，給CML患者的治療帶來的一個全新的時代。TKI在針對CML一線用藥中地位極高，促使著對它的研究不斷進步。目前國際上主要有三代TKI制劑，主要代表藥物為IM、達沙替尼、普納替尼。而對于絕大多數CML患者，IM仍然是以首先選擇的推薦藥物。在臨床工作中，有一部分患者對IM產生原發或者繼發耐藥，影響患者療效。研究表明[2]，IM耐藥可能與BCR-ABL激酶區突變、BCR-ABL基因擴增、能量代謝異常、體內伊馬替尼藥代學、白血病干細胞等機制相關。

1 BCR-ABL激酶區突變

ABL激酶區基因改變是依賴BCR-ABL融合基因耐藥中最常見的耐藥機制，基因改變的后果是阻止與TKI結合。在臨床中，多達40%的患者可能在使用TKI時出現ABL激酶區基因改變[2-3]。也有文獻報道激酶區基因改變發生在30%～90%的對IM抵抗患者中[4]。在Cortes J等[5]研究報道中指出，在169例IM無效患者中共發現了94種ABL激酶區基因改變。最近報道[6]的ABL激酶區突變多達100多種，目前發現的BCR-ABL激酶區基因改變大致可分為4種類型：P環突變、IM結合位點突變(T315/F317)、催化結構域內突變和活化環(A-loop)突變。

1.1 P環突變P環即ATP結合環，位于第248-256氨基酸區域，是ATP磷酸鹽結合的高保真區，該區域常見的突變類型包括有M244 V、G250 E、QZ52 H、Y253 F、Y253 H、E255 K、E255 V等[7]。文獻報道有P環突變CML患者預后更差[8]。但后來研究發現，不是所有CML患者P環發生突變后具有相同的生物學特征及臨床特點，比如，253密碼子的突變顯示出更大的轉化潛能[9]。而在P環發生突變中，第255位密碼子突變發生頻率高[10]。總的來說，P環突變是伊馬替尼耐藥相關突變中較常見的突變部位。

1.2 伊馬替尼結合位點突變(T315/F317) 這個部位的常見突變位點有F311 L、T315 A、T315 L、F317 L、F317 V等，這些突變通過影響伊馬替尼與其結合位點的結合而導致耐藥發生[10]。我們知道T315是一個管家基因殘基，其作用是控制激酶活性位點的疏水區不被ATP結合[11]。315位的蘇氨酸是一個重要的通過氫鍵與TKI結合的重要基團，當它被異亮氨酸替換后，影響了TKI與ABL激酶區結合，從而造成耐藥[12]。而T1315的突變的后果是導致對所有ATP競爭抑制物耐藥，突變導致蘇氨酸被異亮氨酸替代，形成疏水口袋，阻止伊馬替尼的結合，同時大量的異亮氨酸支鏈在伊馬替尼結合位點的中心會形成空間阻礙，阻止激酶抑制劑發揮作用[13]。研究發現第二代TKI抑制劑，如達沙替尼、尼羅替尼和伯舒替尼對其他突變有效，但對T315 I突變均無效[14]。研究也顯示，有T315 I突變的CML患者，預后差[15]。

1.3 催化結構域內突變 催化結構域位點在350～363氨基酸區域，該區域突變主要影響激酶活性。發生在該區域常見的突變有M351 T、E355 G、F359 V、F359 C等，體外誘變實驗表明有些突變細胞株對伊馬替尼耐藥，但對二代酪氨酸激酶抑制劑卻敏感[10，16]。

1.4 活化環 (A-loop) 突變 A-loop結構包括第381-402位氨基酸，起調節激酶活性的作用，阻止激酶向無活性狀態轉化從而使IM 失效。常見活性環突變位點包括L387 M、M388 L、I1396 R、A433 T、FA53 K、FA59 C、FA59 K、E459 Q、F486 S等，其引起IM抵抗是依靠阻礙ABL構象改變成適合IM牢固結合的結構[17]。2016版NCCN CML指南[18]和2016年中國慢性髓性白血病診斷與治療指南[19]，在臨床中，參考上述相關指南，我們可以發現ABL激酶區眾多突變類型中，其中7種有明確指出怎樣換用TKI或者給予其他方式治療：T315 I突變，對一代及二代TKI均無效，在這種情況下可選擇進行臨床試驗，或者選擇另外治療方式；F317 L/V/I/C、V299 L、T315 A突變，一代TKI耐藥，可考慮采用二代TKI尼洛替尼或者選擇其他恰當治療方案；Y253 H、E255 K/V、F359 C/V/I突變，接受達沙替尼方案可以更能獲得滿意療效。針對T315 I突變，可以有第三代TKI普納替尼，但目前該藥物未在國內有使用。也有報道指出，一些CML患者在初始使用普納替尼有效，但是由于持續使用TKI導致激酶區復合突變形成，并對普納替尼產生耐藥[20]。體外研究發現，鎳硫酮可以誘導依托于BCR-ABL和非依托于BCR-ABL融合基因對IM耐藥的CML細胞凋亡，這可能為TKI耐藥提供一個新的治療方法[21]。

高三尖杉酯堿(Homoharringtonine，HHT)可阻止蛋白合成和促進細胞凋亡。Cortes等研究發現[22]應用HHT治療TKI治療失敗或存在 T315 I突變患者的Ⅱ期臨床試驗中發現，對于CML-CP的患者，77%患者可以達到CHR標準，10%可獲得完全細胞遺傳學緩解(CCyR)。正因為HHT治療對TKI耐藥的CML-CP或CML-AP患者均有用。因此，在2014年，美國FAD批準HHT可以用在CML患者身上[23]。2015年，有研究證明阿昔替尼，被獲許可以用來醫治晚期腎臟腫瘤的TKI，表現出對發生T315 I突變的CML患者的惡性細胞有抑制作用。

2 BCR-ABL基因擴增

BCR/ABL融合基因擴增、過度轉錄增多，這個現象在體內體外都已經被觀察到[24-25]。Lee等[26]研究發現，BCR/ABL融合基因轉錄增多為引起CML患者對TKI抵抗的重要因素，部分患者可以通過提高TKI用藥量來達到克服抵抗目的。Gorre等[27]發現，11例非先天性耐藥患者中有3例患者通過檢測，發現BCR-ABL基因轉錄增加。

3 能量代謝異常與耐藥

近年來，白血病細胞發生對化療藥物耐藥的現象涉及到能量代謝異常的現象引起了學者們的高度關注[28]。研究人員在急性白血病耐藥細胞的研究中觀察到相關葡萄糖代謝方面基因表達有增加[29-30]。Hulleman等[31]研究觀察到糖酵解抑制劑的使用可以使耐藥的白血病細胞敏感性增加。進一步研究發現糖酵解的抑制作用是通過誘導配體介導Fas或腫瘤壞死因子相關凋亡來實現[32]。宋奎等[33]研究也發現，以慢性髓系白血病細胞株K562及K562 R為研究對象，用PCR及Western blot方法檢測兩種細胞株中相關的糖酵解基因，結果顯示耐藥細胞株中的糖酵解相關基因活性增加。

4 體內IM藥代學與耐藥

肝臟是體內藥物代謝極為重要部位，許多藥物主要依賴肝P450酶系代謝。服用IM后，其在體內的絕度生物利用度高達98%[34]，治療濃度中，至少95%的IM與血漿白蛋白結合，并且主要是與血漿α1-酸性糖蛋白結合 (AGP)。α1-AGP濃度越大，血漿中未結合IM濃度就低，則IM肝清除率越低；而不同肝臟代謝水平的CML患者，其IM清除率亦不一樣，因此，α1-酸性糖蛋白水平影響IM血漿藥物濃度及細胞內分布。上述因素最后結果是引起CML患者不同人體間IM血藥濃度水平有較大不一樣[35]。在研究如何提高IM對CML敏感性的方法中指出多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的存在，它是一個非單一基因介入的過程，涉及多種抗藥相關的蛋白質，其中MDR1編碼的P-gp蛋白介導的MDR現階段有最多相關研究[36]。P-gp是ATP依托性的藥物泵，依靠水解ATP達到供能量目的，把進入細胞內的藥物泵出細胞，因此P-gp活性高的細胞內IM的水平較低[37]。P-gp抑制劑依靠競爭性結合P-gp，使IM在細胞內集聚，增加CML細胞中IM濃度，從而使其敏感性提高[38]。由此，我們可以得出IM體內藥代學情況會影響細胞內藥物濃度，從而影響療效，出現耐藥。

5 CML干細胞

我們知道，白血病干細胞(leukemia stem cells，LSC)擁有不受控制的自我更新和快速倍增能力，同時還擁有分化為多種其他細胞可能，并且在治療中不被影響。它的存在會造成白血病耐藥及復發，發生這類情況主要原因是絕大部分LSC處于靜止(GO)期。而這類細胞不能被一般治療腫瘤的藥物清除。早在2004年，CML干細胞就被確認[39]，隨后有相關文獻對其特點進行研究報道，房佰俊等[40]通過分離提取CML患者骨髓中的BCR/ABL＋Flkl＋CD34－的細胞，在植入經亞致死量照射的NOD/SCID小鼠體內，成功復制出CML模型，這進一步證實了LSCs的存在。李珍等[41]也對LSCs特點進行闡述，它具有可以通過抑制某些信號傳導途徑(如：JAK-STAT途徑、WNT/β-catenin信號通等)調節BCR/ABLl的穩定、抑制自噬等作用以維持其在體內殘留的特點。Fang等[42]的研究，在對bcr/abl＋Flk1＋CD31－CD34－細胞的研究中證實，IM對非幼稚的惡性白血病細胞具有明顯的阻滯其生長作用，但對CML的原始LSCs則可能是部分、甚至是完全無效的。因BCR-ABL激酶區活性在使用TKI治療時被抑制，選擇性保護機制使LSCs處于靜止狀態而保持其活性[43]。

我們知道，正常造血干細胞的正常生長受到骨髓微環境的影響，同樣，有研究表明，LSCs也受骨髓微環境的調節，并且通過微環境中的物質相互作用可能對LSCs在TKI治療時起到保護作用[44]。因此，LSCs的存在是絕大多數CML復發根源。

在維持骨髓中殘留白血病細胞不能被檢出的CML患者中，有約一半患者在停用TKI治療后，疾病能夠處于長期緩解狀態，但是絕大多數CML患者仍然需要長期持續使用TKI以防止疾病復發，由此帶來的藥物毒性、巨大花費等不利因素。因此，亟需有針對LSCs的靶向藥物出現。近年來，隨著對白血病干細胞的研究深入，針對CML干細胞的治療藥物有的還在試驗階段，有的已應用于臨床。Puneet等[45]研究發現，PORCN抑制劑專門針對LSCs或更早期細胞，能夠有效抑制Wnt信號通路，并且對正常造血沒有影響。

綜上所述，CML對IM耐藥機制極其復雜，在臨床工作中，我們在對所有一線使用以IM的CML患者，在各時間段未達到最佳反應者，應該實時評估患者情況，包括患者治療遵醫囑程度、對藥物是否發生嚴重副反應等因素，必要時需要完善ABL激酶區基因突變檢測等，以便可以恰當改變治療策略，以盡可能避免疾病進展，延長患者壽命，提高患者生活質量。同時，針對耐藥發生機制，可以嘗試聯合使用其他作用機制抑制腫瘤細胞的藥物治療，使患者獲益。