慢性疼痛共患抑郁癥的神經環路

一、研究背景

慢性疼痛與抑郁癥共病現象在臨床上很常見，這導致共病的病人更難治療。抑郁癥狀可以導致疼痛時間延長和程度加深，從而使疼痛和抑郁癥狀之間產生惡性循環。找到有效的治療CDS的措施仍然是此領域面臨的巨大挑戰。以往的研究表明，5-HT能系統功能異常參與抑郁和慢性疼痛。在疼痛調節的下行通路中，廣泛認為5-HT系統下行調節疼痛感覺。疼痛也受到多個中樞腦區的調節，如丘腦、杏仁體、內側前額葉和島葉等，其中多個區域接受5-HT的上行投射。但是，慢性疼痛是否以及如何影響5-HT的上行投射系統并調節抑郁的中樞機制還很不清楚。在中樞神經系統中某些腦區，如杏仁核和DRN既參與慢性疼痛也參與抑郁癥的調節。在神經解剖結構上，慢性疼痛和抑郁癥狀之間如何關聯還知之甚少。慢性疼痛時上行5-HT能神經系統功能改變是否導致CDS并不清楚。眾所周知，杏仁復合體與恐懼學習、焦慮以及疼痛等相關。杏仁體中央核(CeA)被稱為“痛覺杏仁體”，是杏仁體主要的功能輸出部位。深度加工的、多模態的信息從丘腦、皮質和腦干到達CeA，CeA再與前腦和腦干的腦區相連，參與恐懼和情緒加工。以往的這些結果提示CeA可能是慢性疼痛和抑郁的交匯點。然而，CeA環路的適應性改變和CDS的發病機理之間的因果關系尚不清楚。基于杏仁體和5-HT系統均參與調節疼痛和抑郁癥狀，該文研究了介導CDS的CeA環路機制以及慢性疼痛狀態下5-HT系統在環路中的作用和對抑郁樣行為的調節。

本研究結合病毒追蹤、電生理學、光遺傳學、化學遺傳學等方法，剖析了DRN→CeA神經環路的功能性組合，探討了這條神經環路在慢性疼痛雄性小鼠中適應性改變的原理。此外，本研究還運用靜息態功能性磁共振成像評估了這種小鼠模型中的神經環路與CDS病人的環路的相關性。

二、主要結果

1.5-HT1ARs介導5-HTDRN→SOMCeA抑制性神經通路

杏仁體CeA部位95%神經元含有抑制性神經遞質GABA。研究首先用Cre依賴的逆向跨單突觸病毒追蹤方法，顯示谷氨酸脫羧酶2（glutamic acid decarboxylase 2，GAD2，編碼GABA合成酶的基因）-Cre小鼠CeA部位GABA神經元上一級輸入神經元。除了已經熟知的輸入部位，如杏仁體基底外側部（BLA）和丘腦室旁核；本研究還發現DRN核團中有DsRed標記的神經元，說明DRN中神經元能支配CeA部位的GABA能神經元。這個結果非常有意義，因為已知5-HT系統參與調節抑郁癥，常用的抗抑郁藥，如帕羅西汀等，均是作用于這個系統發揮抗抑郁效果。

研究進一步明確了CeA部位GABA抑制性神經元三種亞型(PV、CR、SOM)的輸入環路。研究使用了小清蛋白(parvalbumin, PV) -Cre、鈣結合蛋白(calretinin, CR) -Cre、生長抑素(somatostatin,SOM) -Cre三種轉基因小鼠，將Cre依賴的逆向跨單突觸病毒注射于CeA部位。結果顯示DRN中DsRed標記的神經元只出現在SOM-Cre小鼠中，并且通過免疫熒光染色鑒定發現DsRed標記的神經元是5-HT能神經元。為進一步明確這個結果，作者用依賴Cre表達光敏感通道蛋白2 (AAV-DIOChR2-mCherry)注射到Pet1-Cre小鼠（Cre只在5-HT能神經元中表達）的DRN中，4周后切片結果顯示CeA部位有很多mCherry陽性纖維，并且所有的mCherry陽性神經元對藍光(473 nm)刺激敏感，95%的mCherry陽性神經元是5-HT神經元。上述結果顯示5-HTDRN神經元與SOMCeA神經元形成單突觸聯系。

用SOM-Cre和Pet1-Cre小鼠分別與Ai9小鼠雜交，在全細胞膜片鉗記錄腦片上分別標記出SOM-tdTOM和5-HT (Pet1-tdTOM)能神經元。來自DRN的神經纖維投射到SOMCeA神經元的近側樹突和胞體上。藍光刺激5-HTDRN神經元上ChR2誘導SOMCeA神經元產生超極化電流，此電流被5-HT1AR拮抗劑翻轉。形態學分析也顯示62.3%的5-HT1AR免疫信號在SOMCeA神經元上。

為了確認光操控CeA部位5-HTDRN神經纖維足以影響SOM陽性神經元的活動，本研究檢測了光刺激5-HTDRN末梢后SOMCeA神經元的動作電位頻率和c-Fos的表達。光抑制CeA部位5-HTDRN神經纖維增加c-Fos表達，其中74.7%的c-Fos和SOM免疫熒光共標。全細胞膜片鉗記錄顯示光興奮CeA部位5-HTDRN神經纖維降低SOMCeA神經元放電頻率，這種作用被5-HT1AR拮抗劑阻斷。相比之下，光刺激CeA部位5-HTDRN神經纖維誘導SOM陰性神經元去極化，這種作用被5-HT2AR拮抗劑阻斷。免疫熒光顯示79.3%的5-HT2AR表達于SOM陰性神經元。光興奮CeA部位5-HTDRN神經纖維增加SOM陽性神經元的mIPSCs頻率，5-HT2AR拮抗劑阻斷了這種增加的mIPSCs頻率。上述結果提示5-HTDRN神經纖維投射到SOMCeA神經元，導致其超極化；CeA部位SOM陰性神經元抑制局部的SOM陽性神經元。

2.慢性疼痛小鼠腦內5-HTDRN→SOMCeA神經通路發生去抑制

為了研究5-HTDRN-SOMCeA環路在CDS中的作用，本研究采用了保留性坐骨神經損傷(Spared nerve injury, SNI)誘導的神經病理性疼痛和完全弗氏佐劑(Complete Freund's adjuvant, CFA)誘導的炎癥性疼痛模型。SNI后6周和CFA注射后3周，小鼠產生了明顯的抑郁樣行為。在Pet1-tdTOM小鼠CeA部位注射CTB-488標記投向CeA部位的DRN中5-HT神經元，電生理記錄這些神經元顯示SNI后6周時放電數目減少。在體微透析也檢測到CeA部位的5-HT濃度在SNI后6周時減少。

如果SOMCeA神經元被5-HTDRN神經元輸入抑制，那么在慢性疼痛時這種輸入減弱將去抑制SOMCeA神經元。研究觀察到SNI后6周時SOM陽性神經元的發放頻率增加了，但靜息膜電位沒變化。用化學遺傳抑制SNI后6周時SOM陽性神經元的活動減輕了抑郁樣行為。

3.5-HTDRN→SOMCeA神經環路在慢性疼痛伴抑郁樣行為中發揮充分必要作用

考慮到慢性疼痛時5-HTDRN→CeA的輸入減少，本研究用化學遺傳方法興奮5-HTDRN神經元，發現SNI誘導的抑郁樣行為得到緩解，這種作用被局部CeA注射5-HT1AR拮抗劑阻斷。光遺傳激活CeA部位的5-HTDRN神經末梢產生了相似的作用，同時還恢復了SNI誘導的痛閾值的降低。在正常小鼠中，光抑制CeA部位的5-HTDRN神經末梢產生了抑郁樣行為。CeA局部注射5-HT1AR激動劑明顯緩解了SNI誘導的抑郁樣行為。但是CeA局部注射選擇性5-HT重攝取抑制劑(SSRIs)則沒有這種效果。慢性束縛應激(CRS)和慢性社會斗爭失敗應激(SDS)兩種抑郁模型中CeA部位5-HT含量不變。光激活5-HTDRN→SOMCeA神經環路也不影響CRS和SDS誘導的抑郁樣行為。這些結果提示5-HTDRN→SOMCeA神經環路參與調解慢性疼痛誘導的抑郁樣行為，而非其它應激誘導的抑郁癥。

4.外側韁核作為5-HTDRN→SOMCeA環路的輸出部位調控小鼠慢性疼痛伴抑郁樣行為

AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒注射到SOMCre小鼠CeA部位，在外側韁核（LHb，參與抑郁的核團）觀察到大量的mCherry陽性纖維。出乎意料的是，光興奮LHb中SOMCeA神經末梢能誘導出近一半(12/25)的LHb神經元產生興奮性突觸后電流(EPSCs)和抑制性突觸后電流(IPSCs)。但是也有近一半(11/25)的LHb神經元只有EPSCs，只有極少數(2/25)的LHb神經元只有IPSCs。在GAD2-Cre和CaMKII-Cre小鼠的LHb注射逆向跨單突觸病毒，結果顯示CeA部位中DsRed標記的神經元只在CaMKII-Cre小鼠中觀察到，在GAD2-Cre小鼠中并未觀察到。CeA部位中DsRed標記的神經元與SOM和VGLUT2共標，而且絕大多數(82.9%)DsRed神經元有5-HT1AR，很少(9.6%)有5-HT2AR。順行跨單突觸病毒結合免疫熒光也證明了SOMCeA在LHb下一級神經元是VGLUT2陽性。電生理記錄顯示SNI后6周時LHb中CaMKII陽性神經元放電增加。光遺傳激活LHb中SOMCeA神經末梢使正常小鼠出現抑郁樣行為，相反光抑制SOMCeA神經末梢使SNI后6周小鼠抑郁樣行為減輕。

為了證明5-HTDRN→SOMCeA→GluLHb環路的聯系，研究者在LHb注射逆向AAV (AAV2/2Retro-CMV-bGl-Cre-EGFP)使得SOMCeA神經元表達Cre-GFP，再在CeA部位注射Cre依賴的逆向跨單突觸病毒。結果顯示DRN中出現了很多DsRed陽性神經元，并且是5-HT陽性。為了證明5-HTDRN→SOMCeA→GluLHb環路的功能，研究者用SOM-tdTOM小鼠在LHb注射CTB-488來標記投射到LHb的SOMCeA神經元，DRN注射AAV-hSyn-ChR2-mCherry。腦片電生理記錄發現光興奮CeA中5-HTDRN纖維誘導CTB-488標記的SOM陽性神經元超極化，這種作用被5-HT1AR阻斷。這些CTB-488標記的SOMCeA神經元在SNI后6周興奮性增加，且不受5-HT2AR拮抗劑的影響。這些結果說明5-HTDRN→SOMCeA→GluLHb環路可能參與調解CDS病人的抑郁樣行為。

5.CDS病人DRN和CeA的功能連接減弱

研究進一步運用靜息態fMRI評估了該環路在疼痛抑郁共病的病人是否也發揮作用。與沒有慢性疼痛的抑郁癥病人相比，CDS病人的杏仁體中央內側核(CM)與多個腦區（包括DRN）間的功能連接降低。尤其是DRN-CM通路的功能連接降低只出現在慢性疼痛共病抑郁病人。在無慢性疼痛的抑郁癥病人和慢性疼痛無抑郁癥的病人不存在這種降低。而且在慢性疼痛共病抑郁病人，這個通路的功能連接與抑郁量表呈負相關。這些結果提示慢性疼痛病人的DRN-CM連接和抑郁癥狀有關聯。

三、討論

選擇性5-羥色胺再攝取抑制藥(SSRIs)對慢性疼痛共患抑郁癥狀(CDS)病人的治療效果遠不能令人滿意，這表明CDS中涉及一種獨特的神經環路機制。與這一現象相一致，本研究證明在杏仁體的中央核(CeA)注射帕羅西汀對慢性疼痛小鼠的抑郁樣行為沒有明顯影響。相比之下，激活CeA中5-HT1ARs能減少這些小鼠的抑郁樣行為，表明5-HT1ARs 介導的5-HTDRN→SOMCeA神經環路可能在慢性疼痛引起的抑郁樣行為中發揮作用。SSRIs通過至少14種5-羥色胺(5-HT)受體亞型調節整個大腦的5-HT能系統，因此，SSRIs對多種5-HT受體亞型的整體作用，可能導致無法有效治療CDS病人。事實上，SSRI抗抑郁藥的確切靶點仍然難以確定。因此，單一的5-HT受體亞型，如5-HT1ARs，可能作為開發治療CDS病人的抗抑郁藥的新靶點。

研究疾病的神經環路的優點是能夠揭示影響藥物作用和病理性行為后果的共同位點。本研究提出了一種導致CDS的神經環路的假設，即慢性疼痛通過SOMCeA神經元上的5-HT1ARs導致5-HTDRN→SOMCeA神經環路的去抑制，并且由此產生的LHb神經元活動增強導致抑郁癥狀。已經發現CDS以一種狀態依賴性方式出現，伴隨著CeA中5-HT的降低和SOMCeA神經元活性逐漸增加。疼痛的持續時間對于動物的抑郁很重要，因為小鼠在SNI手術后6周才表現出抑郁樣行為。這種行為結果可能歸因于進行性疼痛期間的動態網絡活動。5-HTDRN→SOMCeA神經環路在SNI慢性疼痛模型6周小鼠中的適應變化改變了LHb的活動，從而促進了抑郁樣行為的發生。研究發現激活5-HTDRN→SOMCeA神經環路減輕了慢性疼痛小鼠的抑郁樣行為，但對慢性應激小鼠引起的抑郁行為沒有影響，表明這種神經環路可能只在慢性疼痛時參與。這一點與臨床的fMRI的數據一致。基于來自動物和臨床的數據，本研究提供了關于該神經環路的行為功能的跨物種轉化研究。

包括DRN在內的腦干是將傷害性信息傳送到腦更高中樞的關鍵腦區。然而，上行的5-HTDRN神經系統是否調控CDS仍然不清楚。CeA神經微環路的系列結構提示，SOM陽性神經元的活動穩態至少部分由5-HTDRN輸入精細控制。5-HTDRN投射主要通過突觸后5-HT1ARs介導超極化過程抑制CeA中SOM陽性神經元，而通過突觸后5-HT2ARs興奮SOM陰性神經元。所以在持續疼痛狀態下，SOMCeA神經元的高活動性由雙重去抑制驅動；即通過直接削弱突觸前5-HTDRN輸入和減弱局部SOM陰性神經元功能。此外，5-HTDRN適應不良促進谷氨酸能突觸傳遞的機制可能涉及平行途徑，例如，從外側杏仁體到CeA部位SOM陽性神經元。由于SOM陽性神經元活動受突觸前5-HT的調節，5-HTDRN→SOMCeA神經環路的不良適應可能在慢性疼痛狀態下持續存在。這種復雜的情況可能是CDS病人抗抑郁治療效果不好的原因。

LHb接收來自許多參與應激反應的大腦區域的投射，這些投射可能介導抑郁的不同癥狀。以往的研究表明，在抑郁癥動物模型中，LHb谷氨酸能神經元的突觸傳遞增強。本研究結果表明，SOMCeA神經元主要通過谷氨酸能投射支配GluLHb神經元。因此，患有慢性疼痛和抑郁樣癥狀的小鼠中，可能通過增加的SOMCeA谷氨酸能輸入激活GluLHb神經元活動。該假設支持韁核神經元的突觸效能增強促進嚙齒動物的抑郁樣行為的觀點。因此，我們提出盡管LHb是抑郁病理生理學的共同區域，但5-HTDRN→SOMCeA神經環路的細胞類型特異性調節的改變可能是治療耐藥性抑郁癥發展的普遍機制，包括CDS。此外，盡管5-HTDRN→SOMCeA神經環路可能有助于多種行為產生，如恐懼、焦慮和抑郁，但該環路對LHb的特定投射可能參與慢性疼痛誘導的抑郁樣行為。這些發現說明抑郁癥的不同病因，例如慢性疼痛和壓力應激，可能由不同的神經環路編碼。

本研究發現激活5-HTDRN→SOMCeA神經環路緩解了疼痛癥狀。這種效應可能涉及杏仁體介導的下行疼痛控制系統。由于治療CDS的藥理學選擇仍然有限，這些發現提示使用非藥物療法如深部腦刺激或經顱磁刺激靶向整合性神經通路治療CDS的可能性，從而更好的治療這類疾病。