煙臺地區泡菜中乳酸菌的分離及生理特性研究

摘要：本研究從5種市售泡菜中分離出11株具有乳酸菌特征的菌株，并進行編號，經過氧化氫酶接觸試驗、革蘭氏染色后顯微鏡觀察等進行篩選，初步鑒定為乳酸菌。然后對篩選出的菌株進行淀粉酶及纖維素酶活性試驗等生理生化特性試驗。并將菌株進行保藏，為進一步研究乳酸菌的生理及功能特性奠定基礎。

關鍵詞：泡菜；乳酸菌；分離；生理特性

中國是傳統的泡菜生產國，泡菜種類繁多，國內在面已經做了大量的工作，分離篩選出了許多生產性能優良的菌種，如植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、干酪乳桿菌、彎曲乳桿菌。短乳桿菌、嗜酸乳桿菌等[1]。乳酸菌主要是一類能發酵碳水化合物且產乳酸的細菌的統稱，迄今為止，已命名的乳酸菌起碼有27個屬，含有超過三百種。乳酸菌的特點：革蘭氏染色陽性、活動性較差或無活動性、兼性厭氧，或厭氧，乳酸是主要的或唯一的發酵產物，15℃～45℃是最佳的生長溫度，有良好的耐酸性，在pH<5時生長狀況依然很好[2-4]。

本研究中，根據乳酸菌的形態學特征和生理生化特征，對本地區所收集的各種泡菜中乳酸菌的分離，并進行生理特性研究，為進一步的相關研究提供基礎。

1實驗方法

1.1改良MRS培養基的配制[5]

1.2泡菜樣品處理

稱取10 g泡菜，加無菌水稀釋10倍，榨汁機打碎處理。

1.3菌株培養

把得到的泡菜汁進行梯度稀釋，分別取10-3、10-5和10-6濃度的泡菜汁用涂布平板法接種到添加5% CaCO3的改良MRS培養基上，置于30 ℃培養箱里，倒置培養48 h后觀察。

1.4觀察計數

將產生白色鈣圈的平板上菌落進行計數；

觀察菌落的形態并根據形態特點區分出不同菌株。

1.5分離純化

從平板挑選出形態不一致、長勢良好且有明顯透明鈣圈的菌落在未接種的培養基上采取平板劃線法培養，并將菌株編號記錄。

在第二次劃線的培養基上挑取單菌落作如下實驗操作：革蘭氏染色、過氧化氫酶接觸實驗、顯微鏡觀察、培養基培養。

從第一次液體培養的菌液中取菌再次進行液體培養，再將液體培養后的菌進行保藏，以供后期需要。

1.6過氧化氫酶試驗

從二次劃線分離培養的培養基上挑取試驗菌單菌落涂于滴有一滴3%H202溶液的載玻片上，如有氣泡產生是陽性反應，沒有氣泡產生則為陰性反應。并將過氧化氫陰性的菌作為進一步實驗菌株。

1.7革蘭氏染色

在干凈的載玻片上滴一滴無菌水，從二次劃線的平板上挑去適量單菌落，均勻涂抹開，然后用酒精燈火焰烘干以殺死菌株并固定。用革蘭氏染液進行染色，在100倍油鏡下進行觀察，被染成紫色或藍紫色的為革蘭氏陽性菌，紅色或粉紅色的為革蘭氏陰性菌。

1.8菌液pH的測定

取二次液體培養后的試驗菌，每株一管，用pB-10型pH計測定菌液pH。

1.9酶特性試驗

淀粉酶特性：在改良MRS培養基基礎上按2 g/L的比例加入可溶性淀粉，再加入2%瓊脂制成固體平板，點接種菌種，30℃培養48 h，長出菌落后，加盧戈氏碘液染色，使染液均勻地鋪于平板上，觀察菌落周圍有透明圈的為陽性反應，有淀粉酶活性，是淀粉酶產生菌。

纖維素酶特性：改良MRS基礎培養基中分別加入1%羧甲基纖維素和2%瓊脂制成固體平板，點接種菌液，37℃培養2-4 d。待菌落長成后，把0.1%剛果紅染液均勻地鋪在平板上染色，如果菌落的周圍出現透明圈，則為陽性反應，有纖維素酶活性，是纖維素酶產生菌。

1.10 菌種的保藏

取500 μl經121℃滅菌15 min的50%甘油于EP管中，再取等量菌懸液，混勻后編號，置于-80℃冰箱中保藏。每株菌保藏3管。

2結果與分析

2.1菌落總數

每種泡菜樣品培養后的具體菌落數及所分得的乳酸菌株數。

通過不斷分離純化，從5種泡菜樣品中初步篩選出11株乳酸菌。不同菌株乳酸菌的數量如表2.1所示。散裝泡菜分離出的乳酸菌株數較多，菌種組成也較為復雜。分析原因可知，散裝泡菜大多為賣家自主自然發酵而成，其菌株的產生受原材料及當地的環境中微生物的影響，菌種較為豐富多樣。

2.2菌落形態學觀察結果

通過觀察發現，各菌株菌落多呈圓形，只有少數呈不規則形。菌落的表面多數也是光滑的，只有2菌具有不光滑的表面。多數菌落邊緣整齊，少數菌株邊緣不整齊呈不規則形狀。另外，經前期步驟挑選，所得菌落均具有明顯的鈣圈。

2.3過氧化氫酶接觸試驗及革蘭氏染色結果

通過氧化氫酶試驗和革蘭氏染色篩選后，所得試驗菌株均為革蘭氏陽性菌，過氧化氫酶陰性菌。顯微鏡下觀察可見所有菌株都無芽孢存在，菌體多成球狀，部分菌株有成串現象存在。

2.4 菌液pH測定結果

菌株進行第二次液體培養后，測定菌液的pH絕大多數集中在4.0～4.5之間。平均值為4.04，說明菌株產酸性較好。

2.5 酶活性試驗結果

酶活性試驗結果表明，11株菌中有10株菌有淀粉酶活性，9株菌有纖維素酶活性。具有淀粉酶活性的乳酸菌能水解淀粉，一般能直接利用淀粉產生乳酸，簡化了乳酸生產中傳統的淀粉兩步發酵法。而纖維素酶能夠降解天然纖維素，能夠使大量纖維素資源以及城市纖維素廢料變成人類所需物質。

3結論

實驗從5種泡菜樣品中培養、分離并篩選出了11株菌株。進行菌落形態學觀察。計數菌落總數，記錄菌落形態，并根據透明圈生成情況以及菌落形態差異進一步篩選了實驗菌株。挑取了各菌株的單菌落進行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察菌體形態以球狀居多。測定了菌液的pH，多在3.5～4.5之間，菌株產酸性較好，也為功能性試驗提供了基礎。對菌株進行過氧化氫酶接觸試驗，多數菌株呈過氧化氫酶陰性。進一步進行了淀粉酶及纖維素酶活性試驗等生理生化特性研究，最后將初步鑒定的乳酸菌菌株進行了保藏，為進一步相關功能性研究等奠定基礎。

參考文獻：

[1]張剛.乳酸細菌技術和應用[M]. 化學工業出版社， 2007， 52-54.

[2]彭木，傅文端.乳酸菌的研究現狀及展望[J]. 黑龍江農業科學， 2012， （12）： 132-136.

[3]何擴，張秀媛等.泡菜優質乳酸菌的篩選及其產酸性能鑒定[J].中國調味品， 2002（7）：37-39.

[4]欒金水.乳酸菌的研究應用進展[J]. 江蘇調味副食品， 2010 （1）： 33-36.

[5]宋萍，陳功，王柱.綠色功能菌群發酵制泡菜的中試研究[J]. 四川食品與發酵， 2004， 40（3）： 16-21.

作者簡介：

孫家財（1981-）男，漢族，山東牟平人，職稱：助教，學歷：碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏工程。

孫海峰（1981-）女，漢族，山東廣饒人，職稱：講師，學歷：碩士研究生，研究方向：果蔬加工。