降解亞硝酸鹽的乳酸菌的分離篩選

摘要：從實驗室保藏的菌株中分離純化出乳酸菌 105株，再進行降解亞硝酸鹽初篩試驗，用比色法觀察獲得6株降解亞硝酸鹽能力較強的菌株，再通過計算降解率選出1株降解亞硝酸鹽作用明顯的菌株，該菌株按1% （v/v）接種量接種于125 mg /L NaNO2、pH 6.4 MRS培養基中，于30 ℃培養箱中培養72 h，對 NaNO2的降解率達95.81% 。

關鍵詞：乳酸菌；亞硝酸鹽；降解；

近年來，諸多文獻中報道乳酸菌可降解亞硝酸鹽，許多研究者在接種乳酸菌腌漬發酵蔬菜試驗中發現，接種發酵能顯著降低亞硝酸鹽生成[1，2]。楊潔彬[3]等認為植物乳桿菌經亞硝酸鹽的誘導，能產生亞硝酸鹽還原酶。張慶芳[4]等對乳酸菌降解亞硝酸鹽機理進行了研究，認為其降解機理為：乳酸菌對亞硝酸鹽的降解分為酶降解和酸降解2個階段。在發酵前期，培養液pH值>4.5時，乳酸菌對亞硝酸鹽降解以酶降解為主；發酵后期，亞硝酸鹽的降解主要以酸降解為主。但在其研究過程中，隨著培養時間延長，乳酸菌會產生大量乳酸，而乳酸對亞硝酸鹽具有較強的降解作用。

1實驗方法

1.1改良MRS培養基的配制

以配制1 L液體培養基為例，需要蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，吐溫80 1.0 g，葡萄糖20.0 g，檸檬酸氫二胺2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，磷酸氫二銨2.0 g，蒸餾水950 mL。

1.2平板涂布法

取實驗室保藏的菌株解凍后，用漩渦混合儀混合均勻，然后用酒精消毒涂布器取各菌液100 μL滴在平板上，在酒精燈環境下，轉動平板，移動涂布器，直到沒有明顯液體為止，放至培養箱中培養。在30 ℃下培養48 h后用平板劃線法進行純化。

1.3平板劃線法

用已消毒的牙簽，挑出不同種類的菌種在新的MRS固體培養基上進行平板劃線。在30 ℃下培養48 h后進行第二次劃線培養。與第一次劃線培養平板中的菌種比較，并挑出不同的菌種，再一次進行平板劃線以純化。在30 ℃下培養48 h。

1.4過氧化氫酶實驗

在載玻片上滴一滴濃度為3%的過氧化氫溶液，從第二次劃線的平板上挑去少量菌，均勻涂抹在溶液上，觀察是否有氣泡產生。有氣泡說明此菌為過氧化氫酶陽性，無氣泡說明此菌為過氧化氫酶陰性。

1.5革蘭氏染色

被染成紫色說明此菌為革蘭氏陽性，被染成紅色說明此菌為革蘭氏陰性。乳酸菌為過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性菌。

1.6 MRS液體培養

用接種環挑取平板上符合條件的菌種，接種到液體培養基中，震蕩。在30 ℃下培養24 h。將第一次液體培養的試管震蕩均勻，從中取1%接種量加入到MRS液體培養基中，震蕩。

1.7降解亞硝酸鹽乳酸菌的分離篩選

1.7.1降解亞硝酸鹽乳酸菌的初篩

將供試菌株活化，取菌齡為18 h的培養液，按1%（v/v）接種量接種于10 mL含NaNO2 125 mg/L，pH 6.4的MRS液體培養基中，30 ℃培養72 h。將培養液混勻，加入2 mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5 min，再加入l mL鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，避光靜置15 min，觀察各培養液的顏色變化，選出顏色較淺的菌株，進行復篩。

1.7.2亞硝酸鹽含量的測定

采用GB 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法對亞硝酸鹽進行測定。

1.7.3降解亞硝酸鹽乳酸菌的復篩

將初篩所得菌株活化，按初篩相同操作進行接種培養，每12 h 取樣檢測亞硝酸鈉含量，以含NaNO2未接種培養基為對照，計算亞硝酸鹽降解率，選取亞硝酸鹽降解力強的菌株。

1.8菌種的保藏

取500 μL經121 ℃滅菌15 min的50%甘油于EP管中，再取等量菌懸液，混勻后標好編號，置于-80 ℃冰箱中保藏。

2 結果與分析

2.1分離純化的乳酸菌株

經過MRS平板培養初步分離純化出溶鈣明顯菌株105株，經過革蘭氏染色鏡檢，過氧化氫酶反應，保存革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性菌株105株。通過比色法篩選出6株降解亞硝酸鹽能力較強的乳酸菌，并進行菌落形態學觀察以及過氧化氫酶實驗和革蘭氏染色。

2.1.1菌落形態學觀察結果

初篩的6株菌株菌落都呈圓形，菌落表面光滑，且多數菌落邊緣整齊，菌落均有較明顯的突起。另外，所得菌落均具有明顯的鈣圈。

2.1.2菌株特性

對初篩的菌株進行過氧化氫酶試驗和革蘭氏染色，篩掉過氧化氫酶陽性和革蘭氏陰性菌，所得菌株均為過氧化氫酶陰性和革蘭氏染色陽性，為乳酸菌株的進一步判斷提供依據。

通過氧化氫酶試驗和革蘭氏染色篩選后，所得試驗菌株均為革蘭氏陽性菌，過氧化氫酶陰性菌。顯微鏡下觀察可見所有菌株都無芽孢存在，且菌體多成桿狀。

2.2亞硝酸鹽降解菌的初篩結果

將105株乳酸菌株按1%（v/v）接種量接入含125 mg/L的亞硝酸鹽的MRS培養液中，培養72 h，其鹽酸萘乙二胺顯色結果分為4類：淺黃色48株，水粉紅色6株，紅色17株，紫紅色34株。結果表明，培養基中相同的亞硝酸鹽經不同乳酸菌的降解作用后，殘留的亞硝酸鈉越少，其紅色越淺。因此，選取其中顯水粉色的6株菌進行降解亞硝酸鹽復篩測定。

2.3亞硝酸鹽標準曲線的繪制

測得亞硝酸鹽標準曲線如圖4.3所示。所得回歸方程為： y=0.1506x+0.0039。乳酸菌培養過程中的亞硝酸鹽含量每隔12 h測定一次，共測定72 h。通過此回歸方程可計算出亞硝酸鹽含量的動態變化。

2.4菌株亞硝酸鹽降解率的測定

對6株供試菌株，按1% （v/v）接種量接入含125 mg /L的亞硝酸鹽培養液中，30 ℃培養，每12 h取培養液，測亞硝酸鹽含量，計算菌株在MRS培養基中對亞硝酸鈉的降解率。

除了對照組中亞硝酸鹽含量沒有太大的變化外，且降解率在10%左右，其余各菌對亞硝酸鹽均有一定降解作用。

3 總結

本實驗從實驗室保藏的菌株中分離篩選優良乳酸菌105株菌進行測試，樣本量大，保證了所得菌株優良性狀的穩定。通過比色法篩選得到6株具有降解亞硝酸鹽能力的乳酸菌。其中有5株乳酸菌對亞硝酸鹽具有高降解率（>90%），1株乳酸菌具一定的降解率（72.96%），這6株乳酸菌在12～24 h內降解量最大，36 h后降解量變化相對較小。

參考文獻：

[1]郭曉紅. 甘蘭乳酸發酵過程中亞硝峰消長機制及抑制途徑的研究[J]. 食品與發酵工業. 1988， （4）： 26-34.

[2]孟憲軍. 大白菜乳酸發酵菌種選育及發酵特性的研究[D]. 沈陽農業大學， 1999.

[3]楊潔彬. 乳酸菌的生物學基礎及應用[M]. 北京： 中國輕工業出版社， 1996.

[4]張慶芳，遲乃玉，鄭燕等. 乳酸菌降解亞硝酸鹽機理的研究[J]. 食品與發酵工業， 2002， 28（08）： 55-60.

作者簡介：

孫家財（1981-）男，漢族，山東牟平人，職稱：助教，學歷：碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏工程。

孫海峰（1981-）女，漢族，山東廣饒人，職稱：講師，學歷：碩士研究生，研究方向：果蔬加工。