山楂葉四種不同提取部位指紋圖譜和總黃酮含量的比較研究*

高 婧，李明臣，徐寶欣，李艷榮，潘海峰△

（1.承德醫學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北承德 067000；2.承德市食品藥品檢驗檢測中心；3.河北省灤平縣中醫院）

基礎醫學

山楂葉四種不同提取部位指紋圖譜和總黃酮含量的比較研究*

高 婧1、2，李明臣3，徐寶欣1，李艷榮1，潘海峰1△

（1.承德醫學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北承德 067000；2.承德市食品藥品檢驗檢測中心；3.河北省灤平縣中醫院）

目的:通過建立高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜和測定總黃酮含量，比較分析山楂葉四種不同提取部位：山楂葉50%乙醇提取部位（A）、中國藥典收錄的山楂葉過大孔樹脂后醇提取物(B)、山楂葉乙酸乙酯部位(C)、山楂葉正丁醇部位(D)。方法：采用HPLC法建立山楂葉指紋圖譜，采用Diamonsil C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，乙腈-0.1%冰醋酸-四氫呋喃為流動相梯度洗脫，檢測波長320nm，流速0.9ml/min，柱溫30℃。總黃酮含量測定采用紫外分光光度法。結果：山楂葉四種提取物指紋圖譜共有峰的種類和數量存在差異，C與其它三種提取物的差別最大；提取物B的總黃酮含量最高。結論：本研究可為山楂葉提取物的進一步開發利用奠定基礎，也能為研究山楂葉不同提取部位藥效學差異提供一定的參考。

山楂葉；指紋圖譜；總黃酮；提取部位

山楂葉為薔薇科植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge.Var. major N. E. Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥葉，有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂之功效。因多靶點的綜合治療作用及較低的毒副作用，山楂葉正逐漸被開發利用制成不同的山楂葉制劑。市售山楂葉制劑以山楂葉不同提取部位為原料，如山玫膠囊[1]和心安膠囊[2]以山楂葉50%乙醇提取部位為原料，益心酮片[1]以山楂葉乙酸乙酯部位（2010版中國藥典以前）為原料。根據山楂葉的化學成分主要為三萜類和黃酮類兩大類的特點[3]，本研究對山楂葉四種不同提取部位，50%乙醇提取部位（A）、中國藥典收錄的山楂葉過大孔樹脂后醇提取物(B)、山楂葉乙酸乙酯部位(C)、山楂葉正丁醇部位(D)的HPLC對照指紋圖譜和總黃酮含量進行了對比分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200 Series液相色譜儀、Agilent-8453紫外分光光度計（安捷倫科技有限公司），AG245電子分析天平(梅特勒-托利多)，KQ-700型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 A，10批，由御室金丹藥廠提供；B，10批，購于西安斯諾特生物技術有限公司。C、D，自制，各10批。綠原酸（批號110753-201415）、牡荊素鼠李糖苷（批號111668-200602）、金絲桃苷（批號111521-201507）、牡荊素（批號100081-200907），中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用；牡荊素葡萄糖苷（批號151103），上海融禾醫藥科技有限公司；蘆丁（批號100080-201409），中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，Fisher科技有限公司；實驗用水，哇哈哈純凈水；其它試劑為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立與分析

2.1.1 色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B）-四氫呋喃（C），梯度洗脫，梯度程序見表1。檢測波長320nm，流速0.9ml/min，柱溫30℃，供試品溶液和對照品溶液進樣量均為10μl。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 混合對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸（S1）10.23mg、牡荊素葡萄糖苷（S2）10.59mg、牡荊素鼠李糖苷（S3）13.28mg、牡荊素（S4）10.01mg、蘆丁（S5）10.11mg、金絲桃苷（S6）10.15mg，置同一100ml容量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，過0.45μm微孔濾膜，作為對照品溶液。

2.1.3 山楂葉提取物C和D的制備：⑴C的制備：取山楂葉藥材50g，加6倍量50%乙醇浸漬48h，滲漉，收集漉液，減壓回收乙醇至相對密度為1.04（60℃）的清膏，加等量水稀釋后，加1/6倍量石油醚（60℃～90℃），振搖，取水層，用0.7倍量乙酸乙酯振搖提取，提取液減壓回收乙酸乙酯并濃縮至干，即得。⑵D的制備：取山楂葉藥材30g，加5倍量50%乙醇加熱回流提取2次，合并提取液，減壓回收至無醇味，用3倍量水飽和的正丁醇振搖3次，合并正丁醇提取液，減壓回收正丁醇并濃縮至干，即得。

2.1.4 供試品溶液的制備：精密稱取山楂葉四種提取物0.1g，分別置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇溶液10ml，超聲提取30min，濾過，作為供試品溶液。

2.1.5 指紋圖譜的建立：將四種提取物各10批供試品溶液按2.1.1的色譜條件進樣測定。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（國家藥典委員會2004A），將10批樣品色譜峰數據以中位數法生成對照指紋圖譜，并對共有峰進行標定，見附圖：

附圖 四種山楂葉提取物的對照指紋圖譜和共有峰

2.2 測定總黃酮含量[1]按照《中國藥典》2015年版山楂葉提取物項下的總黃酮含量測定方法，得標準曲線方程Y=0.01307X(r=0.9998)。總黃酮含量測定結果：B總黃酮含量最高，C次之；A和D的含量接近，比較低。見表2：

表2 四種提取物總黃酮含量測定結果

3 討論

本研究分別建立了山楂葉四種提取物指紋圖譜的共有模式，從對照指紋圖譜可見四種提取物均含有S1-S6這6種主要成分。提取物A-D分別得到18個、18個、25個、20個共有峰，A和B共有峰的數目一樣，但所含化學成分的種類稍有不同；D共有峰數目比A、B多2個；C對照指紋圖譜相對于其它3種提取物圖譜，共有峰數目、種類明顯不同。本研究提示，山楂葉四種提取物化學成分的種類存在明顯差異，藥理作用可能不同，差異有待進一步研究。

本研究測定總黃酮含量采用的是傳統紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，通過形成絡合物顯色來測定，這種方法雖然存在一定的局限性，但大部分黃酮類成分均可以被檢出。比較四種提取物的總黃酮含量，提取物B的總黃酮含量遠高于其它3種。很多研究已經證實了黃酮類成分的多種藥理活性[4-6]，如抗血栓、調節脂代謝等。鑒于本研究發現的山楂葉四種提取物總黃酮含量明顯不同，因此建議臨床用藥時考慮山楂葉總黃酮的含量。

總之，本研究建立的實驗方法科學、準確，可為山楂葉提取物的進一步開發利用提供理論依據，也能為進一步的譜效學研究奠定基礎。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.506，1023，32.

[2]中華人民共和國衛生部藥典委員會，中華人民共和國衛生部藥品標準.中藥成方制劑(第三冊)[M].北京：中華人民共和國衛生部藥典委員會，1992.53.

[3]郝東方，楊芮平，周玉枝，等.山楂葉的化學成分[J].沈陽藥科大學學報，2009，26(4)：282-284.

[4]龐文悅，王蓮，張榮泉.山楂葉總黃酮生物活性研究近況進展[J].食品研究與開發，2014，35(17)：134-136.

[5]Arslan R, Bor Z, Bektas N, et al. Antithrombotic effects of ethanol extract of Crataegus orientalis in the carrageenan-induced mice tail thrombosis model[J]. Thromb Res, 2011, 127(3): 210-213.

[6]楊宇杰，林靜，王春民，等.山楂葉總黃酮對大鼠高脂血癥早期干預的實驗研究[J].中草藥，2008，39(12)：1848-1850.

COMPARATIVE STUDY ON FINGER-PRINT AND TOTAL FLAVONOIDS CONTENT IN FOUR DIFFERENT EXTRACTION PARTS OF HAWTHORN LEAVES

GAO Jing, LI Ming-chen, XU Bao-xin, et al

(Institute of Chinese Materia Medica/Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine,Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To comparatively analyze 4 different extraction parts (A.50% ethanol extract from hawthorn leaf,B.alcohol extract of hawthorn leaf after macroporous resin,C.ethyl acetate part of hawthorn leaf,D.n-butanol part of hawthorn leaf). of hawthorn leaves by establishing HPLC fi nger-print and detecting total flavonoids content.Methods:The fingerprint of hawthorn leaves was established by HPLC method using Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)chromatographic column, acetonitrile-0.1% acetic acid-tetrahydrofuran as mobile phase with gradient elution, detection wavelength 320nm, fl ow rate of 0.9ml/min, and the column temperature was 30℃. The total flavonoids content was detected by ultraviolet spectrophotometry.Results:The common peaks of 4 extraction parts of hawthorn leaves in types and numbers had differences; The differences between extract C and the other three extracts was the largest. The total fl avonoids content in extract B was the highest.Conclusions:This study can lay foundation for further development and utilization of hawthorn leaves extracts, and also can provide references for studying pharmacodynamic differences of different extraction parts of hawthorn leaves extracts.

Hawthorn leaves; Finger-print; Total flavonoids; Extraction parts

R284.1

A

1004-6879（2018）01-0001-03

* 河北省中醫藥管理局科研計劃項目（2017216）

△ 通訊作者

2017-04-09）