甘油混合條件下微酸性電解水對奶牛乳房炎致病菌體外抑菌效果評價

呂桂芬，烏云達來，李玉坤，張學禮，趙陽，劉露

（1.內蒙古師范大學生命科學與技術學院，呼和浩特 010022；2.呼和浩特民族學院環境工程系，呼和浩特 010051）

0 引 言

奶牛乳房炎是降低奶牛泌乳量、損害乳質，危害奶牛養殖、制約奶牛養殖業發展的重要因素之一，它不僅會影響奶牛泌乳量，誘發其他疾病，造成消費性飼養，而且重度乳房炎還會造成奶牛喪失泌乳能力，從而使部分奶牛被迫淘汰。奶牛乳房炎除了疾病引起的經濟損失，也給人類健康及公共衛生造成巨大危害[1-2]。臨床上，對于奶牛乳房炎的預防措施主要是采取乳頭消毒，而當前市場上乳頭藥浴的主流產品為聚維酮碘等碘制劑消毒劑，但長期應用含碘消毒劑，不僅對奶牛存在一定應激性，損害乳品質，同時也存在殘留問題，對食品安全也有一定影響[3]。

微酸性電解水（Slightly Acidic Electrolyzed Water,SAEW）是在無隔膜電解槽內將一定比例的低濃度氯化鈉和稀鹽酸電解生成。其p H介于4.5～6.5之間，有效氯以HClO形態存在，殺菌力強，作用后可迅速分解且無化學污染[4]。SAEW對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、流感病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒和豬藍耳病毒等各類微生物均有較強的殺滅作用[4-5]。目前SAEW在食品、醫療領域已有廣泛的應用[6-10]。與其他化學消毒劑相比，SAEW殺菌后可完全還原成無毒、無殘留的普通水，排放后對環境無任何污染，對生態環境不會造成危害，而且其制作成本低廉，使用簡單方便[11]。荒井等人使用強酸性電解水消毒奶牛乳頭得到比較好的結果[12]，南松劍等人使用微酸性電解水沖洗奶牛乳房，除菌率達到93%[13]。但單獨使用酸性電解水藥浴乳頭，藥浴后蒸發較快，作用持續時間短，冬季乳頭干裂或凍裂的可能。甘油具有無毒、保濕、防凍功效，普遍適用于化妝品行業[14]，本研究利用SAEW的殺菌能力強、無毒無害、低成本、對環境友好等優點和結合甘油的保濕、防凍等特點，開發一種安全、有效、低成本并且能夠保護乳頭的乳頭藥浴新方法。

1 方 法

1.1 微酸性電解水（SAEW）的制備

微酸性電解水（SAEW）的制備使用本實驗室自制的無隔膜酸性電解水裝置，按照自來水、氯化鈉、鹽酸的質量比1∶0.5%∶0.1%混合，充分攪拌均勻，然后置于酸性電解水發生器的電解槽中，在電壓為25 V、電流為1.5 A、電極距為2.5 mm、極板面積為108 cm2進行電解反應20 min，使用稀HCl和NaOH微調節pH值，通過蒸餾水稀釋方法獲得實驗所需的有效氯濃度（ACC），即得藥浴劑中使用的SAEW。SAEW的有效氯（ACC）的測定采用碘量法。

1.2 甘油對SAEW的ACC和pH的影響

取ACC為60 mg/L的SAEW，分別加入體積百分比3%和10%的甘油，存儲于1.5 L塑料瓶中，塑料瓶置于室內，分別在0、0.05、0.5、1、2、6、12、24 h時測定其ACC和p H值。無加入甘油的SAEW作為對照。

1.3 體外殺菌實驗

1.3.1 試驗菌株

大腸埃希菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）是引發奶牛乳房炎的主要致病菌。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌由內蒙古農業大學獸醫學院提供；無乳鏈球菌（CVCC3940）及停乳鏈球菌（CVCC3701）菌株從中國獸醫微生物菌種保藏管理中心購買。

1.3.2 藥浴劑的配置

SAEW-1:ACC：（30±1.2）mg/L，pH:6.30±0.13，下述簡稱：SAEW（30）。

SAEW-2：ACC：（60.0±1.9）mg/L，p H:6.45±0.24，下述簡稱：SAEW（60）。

SAEW（60）+3%甘油：加入甘油，充分混合，過2 h后立即做實驗。

SAEW（60）+10%甘油：加入甘油，充分混合，過2 h后立即做實驗。

0.5 %聚維酮碘：將5%的聚維酮碘（5%聚維酮碘，石家莊市光華藥業有限公司生產）用無菌生理鹽水稀釋至0.5%，作為對照實驗。

1.3.3 殺菌實驗

1.3.3.1 細菌培養

取出冰柜凍存的待試驗菌株，分別接種于相應培養基中，置于恒溫箱37℃培養48 h；其中大腸埃希和金黃色葡萄球菌接種于牛肉蛋白胨培養基，停乳鏈球菌和無乳鏈球菌接種于THB培養基；取出培養物，選取典型菌落轉種3代備用。保證菌液的濃度在1×106～6×106cfu/mL。

1.3.3.2 對奶牛乳房炎致病菌的消毒效果實驗

在無菌操作常溫條件下，將制備的0.1 mL菌懸液加入裝有0.9 mL的SAEW（30）、SAEW（60）、SAEW（60）+3%甘油、SAEW（60）+10%甘油、0.5%聚維酮碘中，充分混合振蕩，處理不同時間5 s、15 s后，吸取9 mL滅菌的中和劑（0.5%的硫代硫酸鈉）加入到試管中，混勻，作用10 min，進行10倍稀釋，用于培養計數。同時用生理鹽水代替藥浴劑，進行平行試驗，作為陽性對照。

將每個平板均分成4個區域，編號，每個區域滴三滴樣液，每滴10μL。重復三次（4DP法）。所有平板均在37℃恒溫箱中培養，48 h后觀察結果。試驗重復3次，計算各組的活菌濃度（cfu/mL）。其殺菌率由以下公式計算：

2 結果

2.1 甘油對SAEW的ACC和p H的影響

如圖1所示，加入甘油的SAEW隨著存放時間的延長，其ACC含量逐漸降低。放置2 h后，加入3%甘油的SAEW的ACC由59.80 mg/L降到34.27 mg/L，損失43%；加入10%甘油的SAEW的ACC由59.80 mg/L降到25.64 mg/L，損失57%；放置24 h后加入不同濃度甘油的SAEW的ACC損失達到90%。在6 h以內高濃度甘油對SAEW的ACC影響明顯高于低濃度甘油，甘油濃度對ACC的影響較大。

圖1 甘油對SAEW的ACC的影響

如圖2所示，SAEW里加入不同濃度的甘油后，隨著存放時間的延長其p H值明顯下降，但2 h之內下降速度較緩慢，保持在p H 5.5以上。2 h到6 h之間，其pH值下降速度較快，24 h后基本達到3.5。另外，甘油濃度對pH的影響不明顯。

圖2 甘油對SAEW的pH值的影響

2.2 體外殺菌實驗

試驗結果如表1所示，ACC為30 mg/L的SAEW、ACC為60 mg/L的SAEW、ACC為60 mg/L+3%的甘油、ACC為60 mg/L的SAEW+10%甘油的不同奶牛乳頭藥浴劑在反應時間5 s內，對奶牛乳房炎主要致病菌的殺菌率均大于81%，殺菌時間15s內殺菌率均超過88%；這四種藥浴劑的殺菌效果與常用乳頭藥浴劑0.5%的聚維酮碘的殺菌效果比較，發現除了SAEW（30）的個別殺菌率低于聚維酮碘外，其它實驗組基本上達到或超過對照組聚維酮碘的效果。SAEW加不同濃度的甘油后其殺菌率均大于96%，0.5%的聚維酮碘的殺菌率也超過93%。

表1 SAEW、SAEW+甘油、聚維酮碘對奶牛乳房炎主要致病菌的抑菌效果比較（n=3） %

3 討 論

目前，奶牛場常用消毒液有碘伏、次氯酸鈉和新潔爾滅等[15]，均需用水稀釋后使用，藥浴后蒸發較快，作用持續時間短，易造成乳房的重復感染，且對奶牛皮膚有一定的刺激和影響[16]。其中聚維酮碘是由聚乙烯毗咯烷酮與碘結合形成的一種無定形復合物，對皮膚有比較好的濕潤和保護作用，因此廣泛應用于奶牛場的乳頭消毒。但碘制劑消毒液有一定的殘留作用，Bogdan等人發現，碘消毒和乳房乳頭藥浴將增加平均牛奶碘含量從（44±1.6）～（59.3±2.3）μg/1000 mL[3]。

與其它化學消毒劑相比，SAEW殺菌后可完全還原成無毒、無殘留的普通水，排放后對環境無任何污染，對生態環境不會造成危害，而且制作成本低廉，使用簡單方便[13]。但單獨使用SAEW，藥浴后蒸發較快，尤其是冬天可能引起奶牛的干裂和凍裂等缺點。本研究旨在SAEW內加入甘油而研制一種安全、對環境友好、無殘留、成本低廉并且能夠保護皮膚的新型藥浴劑。

實驗結果表明，雖然甘油的加入會SAEW的ACC明顯下降，但在2 h之內殘留ACC仍然能夠保持在較高水平。實驗在ACC為60 mg/L的SAEW內加入3%和10%的甘油，并2 h后進行殺菌實驗，殺菌率基本上達到或超過對照組聚維酮碘的殺菌效果。

考慮到加入甘油后的SAEW的不穩定性，在實際應用中建議使用更高ACC的SAEW，并且現做現用，必須甘油混合后2 h之前進行乳頭藥浴；根據天氣溫度適度調節甘油濃度，建議夏天3%，冬天最高可達10%。消毒步驟應分兩步進行，擠奶前和擠奶后。擠奶前的清洗和消毒，使用無甘油添加的純SAEW,該步驟融合了清水沖洗和藥浴消毒兩個步驟,簡化了生產程序,而且對比效果明顯[13]。擠奶后藥浴使用加入甘油的SAEW，又能消毒也有能保護皮膚。本實驗只是室內殺菌效果觀察，在實際應用過程中需進一步研究具體的消毒方法，比如沖洗、藥浴以及重復浸泡乳頭后ACC降解等試驗，從而確定具體應用過程中的最佳消毒方案。

4 結論

通過體外殺菌試驗證明，在一定條件下，微酸性電解水加入甘油后其消毒效果達到聚維酮碘的同等效果。其意義在于，微酸性電解水與傳統碘制劑相比安全、無殘留、環保等優點，加入甘油后有一定的保護乳頭作用。實驗結果對開發一種安全、有效、環保的新型乳頭藥浴劑提供了理論基礎。