淫羊藿根薄層色譜鑒別方法的建立

黔南州食品藥品檢驗(yàn)檢測院，貴州 都勻 558000

淫羊藿為小檗科植物箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、巫山淫羊藿EpimediumwushanenseT. S. Ying、粗毛淫羊藿EpimediumacuminatumFranch.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.、天平山淫羊藿EpimediummyrianthumStearn、氈毛淫羊藿EpimediumcoactumH. R. Liang et W. M. Yah、光葉淫羊藿EpimediumSagittatumvar.glabratumT.S.Ying的干燥根(夏、秋二季采收，洗凈，曬干)[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿對免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、腫瘤、哮喘、真菌抑制等方面均有一定的作用[2-3]。作為我國傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，淫羊藿根在民間藥用十分普遍，淫羊藿根重在補(bǔ)虛，祛風(fēng)濕，主要用于治療關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕痹痛。淫羊藿根中所含活性成分為黃酮類化合物如：淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等。為有效控制該藥材質(zhì)量，以淫羊藿苷、朝藿定C為對照，采用薄層色譜法鑒別淫羊藿根，操作簡便、成本較低、分離速度快，結(jié)果直觀，易于辨別。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TLC PLATE HEATER Ⅲ薄層板加熱器，SK250LHC超聲波清洗器(上海科導(dǎo)儀器有限公司)，梅特勒AG135電子天平，。

1.2 材料 淫羊藿苷(批號：110737-200415)、藿定C(批號：111780-201503)，對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。淫羊藿根樣品分別采集自貴州各地區(qū)，共11批(見表1)。所有樣品均經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定。樣品洗凈后曬干，粉碎，過三號篩，置干燥器中保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法的考察 稱取S1樣品細(xì)粉0.2 g 4份，分別按下述方法處理后作為供試品溶液：①加乙醇2 mL研磨，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。②加無水乙醇10 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。③加無水乙醇10 mL，加熱回流30 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。④加無水乙醇10 mL，超聲30 min后加熱回流30 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解作為供試品溶液。另取淫羊藿苷對照品及朝藿定C對照品適量，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

取上述供試品溶液及對照品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以氯仿：甲醇：水(13.5∶6∶2)靜置至澄清的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置薄層板加熱器上105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果：方法①主斑點(diǎn)不清晰；方法②主斑點(diǎn)清晰且背景較淺，易于辨別；方法③、④主斑點(diǎn)與背景混為一體，未能辨別。方法②操作簡便，節(jié)時省力，薄層色譜圖譜展距適中,斑點(diǎn)清晰，干擾少，故選擇方法②為供試品溶液的制備方法。

2.2 展開系統(tǒng)的考察 取S1樣品按提取方法②制成供試品溶液，取供試品溶液和對照品溶液各5 μL，點(diǎn)于薄層板上，分別在下述展開系統(tǒng)中展開：①硅膠H板，乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)。②硅膠G板，甲醇-丁酮-氯仿-水(4∶6∶6∶1)。③硅膠G板，氯仿-甲醇-水(13.5∶6∶2)搖勻靜置至澄清的下層溶液。

展開后，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置薄層板加熱器上105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果：系統(tǒng)①與淫羊藿苷對照品對應(yīng)的斑點(diǎn)清晰，分離效果佳，但與朝藿定C對照品對應(yīng)的斑點(diǎn)嚴(yán)重拖尾，未能達(dá)到理想的分離效果；系統(tǒng)②分離效果差，斑點(diǎn)不清晰，嚴(yán)重拖尾；系統(tǒng)③兩個主斑點(diǎn)清晰，分離效果好，背景干擾小。因此選擇③為淫羊藿根薄層色譜鑒別的展開系統(tǒng)。

2.3 顯色方法的考察 取S1樣品按提取方法②制成供試品溶液，取供試品溶液和對照品溶液各5μL，點(diǎn)于薄層板上，在展開系統(tǒng)③中展開，取出晾干，分別在下述方法中顯色：①噴以三氯化鋁試液，晾干，置紫外光燈(36 5nm)下檢視。②噴以5%三氯化鐵乙醇溶液，晾干，日光下檢視。③噴以10%硫酸乙醇溶液，置薄層板加熱器上105℃加熱，日光下檢視。結(jié)果：方法①主斑點(diǎn)熒光不明顯，且有背景熒光干擾，使主斑點(diǎn)邊界不清晰，難辨別，方法②主斑點(diǎn)顏色模糊，與背景色彩對比不明顯，方法③主斑點(diǎn)顏色清晰，邊界清楚，與背景對比明顯，故選方法③為淫羊藿根薄層色譜鑒別的顯色方法。

2.4 點(diǎn)樣量的考察 取S1樣品按提取方法②制成供試品溶液，取供試品溶液1、2、3、4、5、6、10 μL，淫羊藿苷對照品溶液和朝藿定C對照品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以氯仿：甲醇：水(13.5∶6∶2)靜置至澄清的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置薄層板加熱器上105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，結(jié)果供試品溶液以點(diǎn)樣量5 μL效果最佳，點(diǎn)樣量小斑點(diǎn)不明顯，點(diǎn)樣量大則拖尾嚴(yán)重，干擾大，分離效果差。故選5 μL為淫羊藿根薄層色譜鑒別的點(diǎn)樣體積。

2.5 耐用性考察 按照國家藥典委員會“中藥分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則實(shí)施細(xì)則”的相關(guān)要求，進(jìn)行以下耐用性考察。①溫度的考察：進(jìn)行了低溫(4℃)、室溫(20℃)、高溫(40℃)的考察，分離效果均較好，斑點(diǎn)清晰，沒有明顯差異。②濕度的考察：進(jìn)行了低濕度(25%)、中等濕度(50%)和高濕度(75%)的考察，結(jié)果表明在上述條件下都能較好分離，未有明顯差異。

2.6 淫羊藿根的薄層色譜鑒別 取樣品細(xì)粉0.2 g，加無水乙醇10 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。另取淫羊藿苷對照品及朝藿定C對照品適量，加甲醇制成1 mg/mL的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)(通則0502)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13.5∶6∶2)搖勻靜置至澄清的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖1所示。

3 討論

淫羊藿屬植物種類繁多，僅中國就有約47種(不含種下類群)，《中國藥典》只收載了5種，上文中提到的黔嶺淫羊藿(Epimedium leptorrhizum)和水城淫羊藿未被收載于藥典，但二者均是貴州省當(dāng)?shù)孛癖姵Ｓ梅N類。其中，黔嶺淫羊藿(EpimediumshuichengenseS.Z.He)為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載品種，在貴州、四川、湖北、湖南均有分布，種群數(shù)量多，產(chǎn)量及蘊(yùn)藏量大。水城淫羊藿是20世紀(jì)90年代中期何順志教授發(fā)現(xiàn)的新種，目前僅在貴州水城發(fā)現(xiàn)有分布，產(chǎn)地長期作淫羊藿入藥，建議收載于新版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[5]。

淫羊藿根作為我國民間常用中藥之一，應(yīng)對其生產(chǎn)和流通進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載的淫羊藿根僅有性狀描述，缺乏必要的質(zhì)量控制項(xiàng)目。2015年版《中國藥典》一部淫羊藿項(xiàng)下以淫羊藿苷為對照品對其建立薄層色譜鑒別方法，然而，在本實(shí)驗(yàn)開展前，筆者對藥典提取方法及展開系統(tǒng)進(jìn)行多次驗(yàn)證，得到的薄層鑒別圖顯色效果不佳，斑點(diǎn)不清晰，難以辨別，且存在一定拖尾、擴(kuò)散、邊緣效應(yīng)等現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)從提取方法、展開系統(tǒng)、顯色方法等方面對淫羊藿根進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，最終優(yōu)選出上述薄層鑒別方法，該方法簡便、可行、斑點(diǎn)清晰，易于檢出，且分離效果較藥典方法好，專屬性強(qiáng)，為更好地控制淫羊藿根質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。