納米銀洗液對皮膚刺激性與過敏反應試驗研究

成都軍區聯勤部藥品儀器檢驗所，四川 成都 610017

納米銀洗液由納米銀溶液1%(w/w)、十二烷基二甲基芐基溴化銨0.3%～0.6%(w/w)、甘油組成，具有具有消炎、殺菌、止癢作用，臨床對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌等病原體微生物有明顯抑制作用，用于燒燙傷創面感染及其他原因引起的創面感染。為了解該藥經皮滲透對局部及全身產生的毒性反應和反應的恢復程度，根據國家食品藥品監督管理總局關于發布藥物安全藥理學研究技術指導原則等 8 項技術指導原則的通告(2014年第4號)附件《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》，現對該藥分別進行了家兔的皮膚刺激性試驗以及豚鼠皮膚過敏性試驗進行觀察[1]，通過進行臨床前毒理學評價，預測臨床用藥的安全性，為下一步的臨床試驗提供參考。

1 材料

1.1 動物 健康清潔級新西蘭兔(2500±100)g，健康清潔級豚鼠(400%±50)g，雌雄各半。成都達碩實驗動物有限公司提供；動物合格證號:SCXK(川)2013-24。將動物分籠飼養于空調實驗室內，室溫(24±2)℃，相對濕度40%～60%，人工控制晝夜各12h；供以標準鼠塊料，自由飲水，每日換墊料一次；適應性喂養1周備用。

1.2 藥物 納米銀洗液為亮黃色液體(批：20140701，成都軍區聯勤部藥品儀器檢驗所研究)，4℃冰箱保存備用。2,4-二硝基氯苯(CDNB，批號：20120306，上海遠慕生物科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 皮膚刺激性試驗

2.1.1 方法 本試驗采用同體自身對比法，試驗前在家兔背部正中線兩側剪毛或剃毛(面積約3 cm×5 cm)，仔細檢查皮膚，篩選皮膚完整無損的家兔4只，將受試樣品均勻涂布于實驗動物的左側去毛區，并用油紙和兩層紗布覆蓋，再用無刺激性膠布或繃帶加以固定，以保證受試樣品和皮膚的密切接觸，防止脫落和動物舔食實驗樣品。右側去毛區均勻涂抹賦形劑，其余操作同左側。涂布4 h后取下固定物和覆蓋物，用溫水或適當的溶劑洗去皮膚上殘留的受試樣品，觀察局部皮損情況；4 h及8 h后重復上述操作。分別觀察每只家兔給藥后1 h、2 h、3 h、4 h、8 h、24 h及第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14天的皮膚刺激/腐蝕反應情況，并做好詳細記錄。第14天實驗結束后，耳緣靜脈空氣栓塞處死家兔，肉眼觀察家兔心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胰腺、胃、脾、前列腺、睪丸、卵巢、子宮等主要臟器有無明顯病理改變，做好詳細記錄。參照國家食品藥品監督管理局《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》中皮膚刺激性反應評分標準進行評分，并計算平均值，按“皮膚刺激性強度”評價標準進行評價。解剖取下左右兩側的皮膚，10%的中性甲醛固定，進行蘇木精-伊紅染色法染色，光鏡下觀察并做出檢驗報告。如圖1～圖8所示。

2.1.2 結果 涂藥側皮膚組未見明顯紅斑及水腫現象，涂藥部位無色素沉著及出血點，極少數動物2 h后出現紅斑，一般在48～72 h內消退。參照國家食品藥品監督管理局《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》[應按《藥物刺激性過敏性和溶血性研究技術指導原則》來評價，研究的是藥物！]中皮膚刺激性反應評分標準進行評分，并計算平均值，按“皮膚刺激性強度”評價標準進行評價。結果見表1。

表1 納米銀洗液豚鼠皮膚刺激反應分值表

組別刺激反應平均分值1h2h48h72h4d7d10d14d刺激性評價樣品組000.20.20000輕微刺激性陰性對照組00000000無刺激性

2.2 皮膚過敏試驗

2.2.1 方法 試驗前，在豚鼠背部正中線兩側剪毛或剃毛(面積約3 ×5 cm2)，仔細檢查皮膚，篩選皮膚完整無損的豚鼠15只，按照體重性別隨機分為3組：樣品組、陰性對照組和陽性對照組，每組各5只。樣品組將樣品均勻涂布于實驗動物的左側去毛區，并用油紙和兩層紗布覆蓋，再用無刺激性膠布或繃帶加以固定，以保證受試樣品和皮膚的密切接觸，防止脫落和動物舔食實驗樣品；陰性對照組左側去毛區均勻賦形劑材料；陽性對照組左側去毛區均勻涂布1%DNCB；其余操作均同樣品組。4 h后取下固定物和覆蓋物，用溫水或適當的溶劑洗去皮膚上殘留的受試樣品，觀察局部皮損情況；第7天及第14天重復上述操作。分別觀察每只豚鼠給藥后1 h、2 h、3 h、4 h、8 h、24 h及第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14天的皮膚刺激/腐蝕反應情況，并做好詳細記錄。第14天實驗結束后，斷頭法處死豚鼠，肉眼觀察豚鼠心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胰腺、胃、脾、前列腺、睪丸、卵巢、子宮等主要臟器有無明顯病理改變，做好詳細記錄。參照國家食品藥品監督管理局《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》中皮膚過敏反應程度的評分標準和皮膚致敏性評價標準進行評分和皮膚致敏性評價，同時觀察動物是否有哮喘，站立不穩或休克等嚴重的全身性過敏反應。解剖取下左右兩側的皮膚，10%的中性甲醛固定，蘇木精- 伊紅染色法染色，光鏡下觀察并做出檢驗報告。如圖9～圖18所示。

2.2.2 結果 參照國家食品藥品監督管理局《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》中皮膚過敏反應程度的評分標準和皮膚致敏性評價標準進行評分和皮膚致敏性評價 ,同時觀察動物是否有哮喘 ,站立不穩或休克等嚴重的全身性過敏反應。結果見表2。樣品組、陰性組動物在激發給藥后的觀察期內,皮膚反應正常，無紅斑、水腫，致敏率為0%，按標準判定屬于無致敏性物質，動物也無哮喘、站立不穩及休克等現象；各動物體質量增加明顯；解剖肉眼觀察各組織器官未見明顯病理學改變；局部皮膚蘇木精-伊紅染色法染色無明顯病理改變；陽性組動物在各規定時間點,均表現有明顯紅斑、水腫等過敏反應,反應率為100%，個別動物有哮喘現象，無證據表明與用藥的相關性。

表2 納米銀洗液豚鼠過敏反應結果

組別平均反應值0h24h48h72h致敏率/%樣品組00000陰性對照組00000陽性對照組2.65.84.02.2100

3 討論

加強實驗結果的分析(補充)。

本實驗結果表明納米銀洗液的局部毒性小，對皮膚基本無刺激性和致敏作用,提示本品的應用安全性良好，符合皮膚用藥的安全性要求，符合規范[2]要求。