類(lèi)芽孢桿菌WY-01發(fā)酵生產(chǎn)低溫β -甘露聚糖酶培養(yǎng)基的研究

李曉艷, 遲乃玉, 王一茜

(大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 遼寧 大連 116622)

0 引 言

半纖維素是自然界中第2大類(lèi)雜聚多糖,其中β -甘露聚糖是一種主要的半纖維素。甘露聚糖廣存在于槐豆膠、瓜爾豆膠、魔芋精粉和其他植物多糖中[1],β -甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase,EC 3.2.1.78)能夠水解含有β-1,4-D-甘露糖苷鍵的多聚糖(如均一甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖)為甘露低聚糖的酶[2]。甘露低聚糖有良好的生物調(diào)節(jié)功能,能夠有效降低人體血糖[3]、膽固醇,作為雙歧因子能夠促進(jìn)腸道中雙歧桿菌的生長(zhǎng),改善菌群結(jié)構(gòu),減少有害細(xì)菌的產(chǎn)生,是良好的食品添加劑[4]。作為一種新型工業(yè)用酶,β -甘露聚糖酶酶廣泛應(yīng)用于飼料、造紙、紡織印染、石油開(kāi)采和生物學(xué)研究等諸多方面[4-7]。

β -甘露聚糖酶廣泛存在于植物、動(dòng)物、人類(lèi)的腸道中,但微生物來(lái)源的酶具有成本低,生產(chǎn)周期短、產(chǎn)酶活性高的特點(diǎn),多年來(lái)一直是國(guó)內(nèi)外研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究主要集中在中高溫產(chǎn)酶菌株的選育[1,8]、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[9-11]、酶的制備工藝優(yōu)化[12-13]、酶基因克隆與表達(dá)[14-16]等方面。國(guó)外(Yutaka Tamaru,O.Politz)[17-18]對(duì)海洋細(xì)菌β -甘露聚糖酶基因進(jìn)行研究,國(guó)內(nèi)張?jiān)乒獾萚19]對(duì)海洋細(xì)菌β -甘露聚糖酶進(jìn)行菌株篩選研究,得到最適作用溫度30 ℃產(chǎn)酶菌株。低溫酶具有低溫高催化活性、高效結(jié)構(gòu)柔順性、熱不穩(wěn)定性等特點(diǎn),使其在應(yīng)用上比中溫酶、高溫酶更有優(yōu)勢(shì)。近幾年來(lái),低溫脂肪酶、纖維素酶、蛋白酶等多種低溫酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),低溫β -甘露聚糖酶研究與開(kāi)發(fā)是大勢(shì)所趨。

本文以遼寧省海洋微生物工程技術(shù)中心從海泥中篩選的產(chǎn)低溫β -甘露聚糖酶的類(lèi)芽孢桿菌WY-01為研究對(duì)象,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),對(duì)其產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行研究,提高其產(chǎn)酶量,為低溫β -甘露聚糖酶的酶學(xué)特性及應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株:類(lèi)芽孢桿菌WY-01篩選自海泥,保藏至遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 培養(yǎng)基:斜面培養(yǎng)基(g/L):瓜豆膠 10,瓊脂粉15,氯化鈉20,pH自然,115 ℃ 0.056 MPa滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L):魔芋粉 10,酵母膏5,蛋白胨3,硫酸鎂0.3,氯化鉀5,磷酸氫二鉀1,硫酸亞鐵0.01,pH自然,115 ℃ 0.056 MPa滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):魔芋粉5,蛋白胨5,磷酸氫二鉀1,氯化鈉10,氯化鉀6,硫酸鎂5,pH自然,115 ℃ 0.056 MPa滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑及儀器:魔芋粉、瓜豆膠、蛋白胨、酵母膏等購(gòu)自Sigma公司,其他試劑均為分析純?cè)噭?LRH系列培養(yǎng)箱、HWS24型電熱恒溫水浴鍋,購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HZP-256全溫振蕩培養(yǎng)箱,購(gòu)自武漢建偉生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 菌株活化:用滅菌的牙簽挑取保存菌株接種于固體種子培養(yǎng)基,置于恒溫培養(yǎng)箱中,25 ℃培養(yǎng)活化。

1.2.2 種子培養(yǎng):挑取單菌落接種于5 mL液體種子培養(yǎng)基中,于25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。按3%接種量將一級(jí)種子液接入100 mL液體種子培養(yǎng)基,于25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h為二級(jí)種子液。

在線條上，畫(huà)面下半部分我都是選擇一些比較圓滑的線條，例如海面上的波浪，沙灘上的波紋。而畫(huà)面上半部分我則是選擇了一些頓一些、起伏不太明顯的線條來(lái)維持整個(gè)畫(huà)面的對(duì)比關(guān)系。但是這些線條也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，所以我還在這些線條的基礎(chǔ)上做了其他的更微妙的線條，例如畫(huà)面中的人物、花草及鳥(niǎo)類(lèi)。這樣一些細(xì)小的、微妙的線條也能打破之前的一些形狀，這樣的碰撞對(duì)于整個(gè)畫(huà)面來(lái)說(shuō)也是好的。在初期定草圖的時(shí)候，我將海浪的起伏感、立體感定位重點(diǎn)之一，將其起伏變化都進(jìn)行了反復(fù)修改，線條的穿插、長(zhǎng)短都是畫(huà)面成功與否的關(guān)鍵。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng):按3%接種量將二級(jí)種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h。

1.3 酶活的測(cè)定方法

1.3.1 底物的處理:粗魔芋粉中含有還原糖,需進(jìn)行預(yù)處理使其變?yōu)榫в蠓?測(cè)定酶活時(shí)作為底物使用。將魔芋粉浸泡于75%酒精中,24 h后換酒精,再浸泡4 d,用斐林試劑檢測(cè)無(wú)還原糖后,加入pH 6.0的磷酸鈉緩沖溶液中備用[20]。

1.3.2 制備粗酶液

250 mL的錐形瓶中配制100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,以3%的接種量接種,25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h,用1 mL移液槍從發(fā)酵培養(yǎng)基中取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL Tube管,4 ℃ 8 000 r/min離心10 min,上清液為粗酶液。

1.3.3 酶活的測(cè)定(DNS法)

在0.9 mL底物(將魔芋粉溶于pH 6.0的磷酸鈉緩沖液中配制20 g/L的溶液作為底物)中加入0.1 mL的粗酶液,50 ℃水浴反應(yīng)10 min。加入DNS試劑2.0 mL,沸水浴5 min顯色,立即以流動(dòng)水冷卻至室溫,加去離子水定容至10.0 mL,以空白液調(diào)零,在540 nm處測(cè)定吸光度。酶活力定義:每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需酶量。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 碳源種類(lèi):配制碳源種類(lèi)分別為0.6%的魔芋粉、淀粉、麥芽、蔗糖、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后接種3%二級(jí)種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h后用DNS法測(cè)定酶活,每個(gè)處理做3個(gè)平行。

1.4.2 碳源濃度:魔芋粉為最佳碳源,濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%配制發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后接種3%二級(jí)種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h后用DNS法測(cè)定酶活,每個(gè)處理做3個(gè)平行。

1.4.4 有機(jī)氮源濃度:以蛋白胨作有機(jī)氮源,濃度設(shè)定為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%配制培養(yǎng)基,滅菌后接種3%的二級(jí)種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h后用DNS法測(cè)定酶活,每個(gè)處理做3個(gè)平行。

無(wú)機(jī)氮源濃度:磷酸氫二銨作無(wú)機(jī)氮源,濃度設(shè)定為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%配制培養(yǎng)基,滅菌后接種3%的二級(jí)種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h后用DNS法測(cè)定酶活,每個(gè)處理做3個(gè)平行。

1.4.5 有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源比例(復(fù)合氮源):以蛋白胨為有機(jī)氮源、磷酸氫二銨為無(wú)機(jī)氮源,有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源比例(復(fù)合氮源)設(shè)定為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1配制發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后接種3%二級(jí)種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h后用DNS法測(cè)定酶活,每個(gè)處理做3個(gè)平行。

1.4.6 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi):在上述最佳優(yōu)化條件下,0.02%的Na+、K+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+配制發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后接種3%的二級(jí)種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h用DNS法測(cè)定酶活,每個(gè)處理做3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類(lèi)及最佳碳源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖1 碳源種類(lèi)對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of carbon source kinds on enzyme production

對(duì)異養(yǎng)微生物來(lái)說(shuō),糖類(lèi)物質(zhì)能夠提供碳素來(lái)源同時(shí)具有能源功能,不但影響菌株的生長(zhǎng),而且影響菌株代謝產(chǎn)物的形成。微生物碳源譜雖廣,但對(duì)異氧微生物來(lái)說(shuō),利用糖類(lèi)物質(zhì)的一般規(guī)律是單糖優(yōu)于雙糖和多糖。由圖1可知,多糖為魔芋粉和淀粉,雙糖為蔗糖、麥芽糖,單糖為葡萄糖。在5種碳源物質(zhì)中,菌株以魔芋粉為主要碳源,其發(fā)酵產(chǎn)生的β -甘露聚糖酶的量明顯比其他4種碳源高,其酶活最高為127.71 U/mL,碳源物質(zhì)為淀粉時(shí)酶活最低為32.2 U/mL。由此可見(jiàn),多糖魔芋粉為其最優(yōu)碳源。一方面是由于魔芋粉能提供碳素營(yíng)養(yǎng)兼具能源功能,進(jìn)而影響細(xì)菌WY-01的生長(zhǎng);另一方面β -甘露聚糖酶是菌株生理代謝的產(chǎn)物,它的產(chǎn)生需要魔芋粉作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)才能產(chǎn)生此酶。

圖2 不同濃度魔芋粉對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of carbon source concentration on enzyme production

由圖2可知,在魔芋粉濃度為0.2%～0.6%時(shí),酶活隨著魔芋粉濃度的升高而增大,0.6%時(shí)酶活達(dá)到最大值為274.65 U/mL;在魔芋粉濃度0.6%～1.0%時(shí),酶活隨著濃度的升高而降低。在魔芋粉濃度為0.2%時(shí),酶活最低為220.41 U/mL。魔芋粉做為最佳碳素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),含有葡苷聚糖。葡苷聚糖吸水性,粘性較強(qiáng)。發(fā)酵培養(yǎng)基中魔芋粉濃度過(guò)高,且具有較強(qiáng)的吸水性和粘性,使菌株生長(zhǎng)環(huán)境的滲透壓變大,菌株因環(huán)境滲透壓變大而失去水分,影響菌株的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的形成,影響β-甘露聚糖酶的合成及其產(chǎn)量;魔芋粉濃度過(guò)低,則菌株由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足而影響生長(zhǎng)與β -甘露聚糖酶的形成,進(jìn)而影響產(chǎn)酶量,由此可確定發(fā)酵培養(yǎng)基中魔芋粉最佳濃度為0.6%。

2.2 氮源種類(lèi)及最佳氮源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖3 氮源種類(lèi)對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source kinds on enzyme production

氮源作為構(gòu)成細(xì)菌生命的大分子物質(zhì)核酸和蛋白質(zhì)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),用來(lái)合成微生物細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物。微生物氮源譜廣,分為無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源,無(wú)機(jī)氮源一般為速效性氮源,一般在菌體生長(zhǎng)時(shí)吸收利用,菌體吸收快利于生長(zhǎng);有機(jī)氮源為遲效性氮源,一般在菌株形成次級(jí)代謝產(chǎn)物時(shí)利用,利于菌體代謝產(chǎn)物的形成。在發(fā)酵過(guò)程中選擇合適種類(lèi)有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源、或有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源比例即復(fù)合氮源種類(lèi)及比例尤為重要。由圖3可知,在4種有機(jī)氮源中,蛋白胨為最佳有機(jī)氮源,酶活最高達(dá)269.69 U/mL;在5種無(wú)機(jī)氮源中,磷酸氫二銨為最佳無(wú)機(jī)氮源,酶活最高達(dá)254.15 U/mL。類(lèi)芽孢桿菌WY-01在發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)期以吸收無(wú)機(jī)氮磷酸氫二銨為其主要氮源滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)需求,在β -甘露聚糖酶的形成時(shí),以蛋白胨為有機(jī)氮源滿(mǎn)足產(chǎn)物的需求。

由圖4可知,在蛋白胨濃度為0.1%～0.2%時(shí),酶活隨濃度的升高而增大,0.2%達(dá)到最大值為228.25 U/mL;在蛋白胨0.3%～0.4%,隨濃度升高,酶活下降,0.3%時(shí)酶活最低為172.46 U/mL。由此可確定最優(yōu)單一有機(jī)氮源蛋白胨的濃度為0.2%。

由圖5可知,在磷酸氫二銨濃度為0.1%～0.2%時(shí),酶活隨濃度升高而增大,在磷酸氫二銨濃度為0.2%時(shí)酶活達(dá)到最大值為204.15 U/mL,在磷酸氫二銨濃度為0.3%～0.4%,酶活隨濃度升高而下降。磷酸氫二銨濃度0.1%時(shí)酶活最低為126.53 U/mL。由此確定最優(yōu)單一無(wú)機(jī)氮源磷酸氫二銨濃度為0.2%。

圖4 不同濃度蛋白胨對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖5 不同濃度磷酸氫二銨對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖6 復(fù)合氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of complex nitrogen source on enzyme production

有機(jī)氮源選用蛋白胨,無(wú)機(jī)氮源選用磷酸氫二銨,且有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源比例分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1。由圖6可知,復(fù)合氮源對(duì)產(chǎn)酶影響較大,當(dāng)有機(jī)氮與無(wú)機(jī)氮的比例為3∶1時(shí),酶活最高達(dá)246.24 U/mL;2∶1時(shí)酶活最低為170.98 U/mL。由此可確定復(fù)合氮源中有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源最優(yōu)比例為3∶1。有機(jī)氮蛋白胨富含有機(jī)含氮的化合物,也含有糖類(lèi)和一些維生素等營(yíng)養(yǎng)成分,為類(lèi)芽孢桿菌WY-01提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子,有機(jī)氮源的物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,菌株利用較慢為遲效性氮源,在發(fā)酵不同階段不同程度影響菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的形成。無(wú)機(jī)氮源的物質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、利用快捷,可做速效性氮源,但在發(fā)酵后期,隨著無(wú)機(jī)氮中的銨鹽被吸收殆盡,發(fā)酵液中的pH值也會(huì)隨之降低酸化,改變環(huán)境中pH,對(duì)酶的合成有一定的阻遏作用,而一定量有機(jī)氮源的存在,在不同程度上對(duì)環(huán)境pH改變有一定緩沖作用,同時(shí)促進(jìn)代謝產(chǎn)物的形成,所以復(fù)合氮源效果最佳,優(yōu)化最優(yōu)的比例能更好的促進(jìn)菌株生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的形成。

2.3 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖7 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of inorganic salt kinds on enzyme production

由圖7可知,6種無(wú)機(jī)鹽離子中,Fe2+對(duì)酶活明顯無(wú)作用,Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+對(duì)酶活有一定促進(jìn)作用,統(tǒng)計(jì)分析表明, K+和Mg2+對(duì)酶活影響顯著。無(wú)機(jī)鹽是微生物生長(zhǎng)必須的元素,一些無(wú)機(jī)鹽構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)一般分子成分;一些無(wú)機(jī)鹽作為生理調(diào)節(jié)物質(zhì)。有些無(wú)機(jī)鹽作為微生物酶的激活劑,作用于微生物酶的活性部位,促進(jìn)酶制劑的產(chǎn)生;有些無(wú)機(jī)鹽作為酶的抑制劑,對(duì)產(chǎn)酶起一定程度的抑制作用。無(wú)機(jī)鹽是影響產(chǎn)酶的重要因素。

2.4 在上述最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件下類(lèi)芽孢桿菌WY-01發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶活測(cè)定

對(duì)類(lèi)芽孢桿菌WY-01發(fā)酵生產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶菌株培養(yǎng)基通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究魔芋粉濃度為0.6%,復(fù)合氮源濃度為0.2%,復(fù)合氮源蛋白胨與磷酸氫二銨的比例為3∶1,氯化鈉0.1%,氯化鉀0.6%,硫酸鎂0.5%,在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件下產(chǎn)酶活力達(dá)到276.24 U/mL,未優(yōu)化前酶活最大為168.71 U/mL,是優(yōu)化前的1.64倍。

3 結(jié) 論

對(duì)類(lèi)芽孢桿菌WY-01發(fā)酵生產(chǎn)低溫β -甘露聚糖酶的培養(yǎng)基進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),從碳源種類(lèi)、碳源的濃度,氮源種類(lèi)、氮源濃度、有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源的比例、無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)進(jìn)行優(yōu)化,提高其產(chǎn)酶量。結(jié)果表明:最佳碳源為魔芋粉,濃度為0.6%;最佳有機(jī)氮源為蛋白胨,濃度為0.2%,無(wú)機(jī)氮源為磷酸氫二銨,濃度為0.2%,有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源的比為3∶1。統(tǒng)計(jì)分析表明:Fe2+、Na+、Ca2+、Zn2+對(duì)產(chǎn)酶影響不顯著,K+和Mg2+對(duì)產(chǎn)酶影響顯著。在上述最佳營(yíng)養(yǎng)條件下酶活力達(dá)276.24 U/mL,未優(yōu)化前酶活最大為168.71 U/mL,是優(yōu)化前的1.64倍,這一結(jié)論為類(lèi)芽孢桿菌WY-01后期的發(fā)酵放大與潛在的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考。