動物學實驗教學中“原生動物的結構觀察”伸縮泡觀察方法的優化

關萍　李嵐　呂秋鳳

摘 要：應用低濃度美蘭染色液（2.0%）對原生動物進行梯度微麻醉，麻醉后的蟲體活動性減弱但伸縮泡活動狀態良好，能夠較清晰的觀察伸縮泡及收集管的交替活動，可計數活動頻率，且這種狀態的維持時間較長（約19min）。為將細胞壓制為既較薄又不破碎，實驗應用低濃度（1%）甲基纖維素作為支撐物，結果表明，該方法操作簡單，效果較好，適用于高校或中學動物學實驗的課堂操作。

關鍵詞：原生動物；伸縮泡；收集管；美蘭染色；甲基纖維素

中圖分類號 Q95-33 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）19-0129-03

Improvement of the Observation Method of Contractile Vacuole of “Expansion of Protozoa” in Zoology Experimental Teaching

Guan Ping1 et al.

（1School of Biological Science and Technology， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract：Protozoa was carried out with low concentration of methylene blue staining solution （2.0%） to be gradient micro-anesthetized.The activity of the insects after anesthesia was weakened but the activity of the contractile vacuole was good.It was possible to observe the alternating activities of the contractile vacuole and the collecting tube more clearly.The activity frequency can be counted.This state is maintained for a longer period of time （about 19minutes）.To suppress the cells to be both thin and not broken， the experiment used low concentrations （1%） of methyl cellulose as a support.This method has a simple operation and is suitable for classroom operation in laboratory experiments in middle schools or colleges.

Key words：Protozoa；Contractile vacuole；Collecting canals；Methylene blue staining；Methyl cellulose

動物學實驗是高等院校普遍開設的必修課程之一，農業院校中開設動物學實驗的專業更加廣泛，課時較多，每個實驗項目修習的內容也更加深入。“原生動物的結構觀察”是動物學實驗的必修科目，尾草履蟲[1]是這個實驗中最為常用的實驗材料。農業院校畜牧獸醫、生物科學和生物技術等專業對于這個實驗項目的要求較高，除了常規的胞器（細胞核、食物泡和刺絲泡等）觀察外，伸縮泡也是必須觀察的胞器。針對該實驗，許多教學和科研人員對尾草履蟲細胞器的觀察方法進行了改進和優化[2-3]，對細胞核、食物泡和刺絲泡等胞器均取得了較好的觀察效果[5-6]。較之上述器官，伸縮泡結構復雜，動態活動性強，想在課堂較短時間內得到良好的效果略有難度。因此，探尋適用于課堂教學，利于學生操作的方法進行伸縮泡的觀察，是實驗指導教師和理論課授課教師一直關注的問題。本文將報道一種較為有效的觀察草履蟲伸縮泡動態變化過程的簡易方法，供動物學實驗教學人員參考。

1 材料

1.1 動物材料 尾草履蟲（Paramecium caudatum）：采集于沈陽市馬官橋下，培養于沈陽農業大學生物科學實驗室，繁殖至150代左右且密度較大時用于本實驗。

1.2 試劑 石碳酸品紅溶液、美蘭染液、醋酸、戊巴比妥鈉、乙醇、生菜汁培養液、甲基纖維素等。

1.3 儀器和用具 恒溫培養箱、體式顯微鏡、顯微鏡及攝像系統、恒溫震蕩器、冰箱、電子天平、微量移液器、低速離心機等。培養皿、試管、膠頭滴管、微吸管、載玻片、蓋玻片等。

1.4 消耗性材料 槍頭、離心管、濾紙、脫脂棉等。

2 方法

2.1 尾草履蟲伸縮泡觀察時麻醉劑的添加及觀察

將梯度濃度的5種常用化學試劑分別配制為0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%等7個梯度濃度，分別加入預先放入100只尾草履蟲的厚凹片中滴加5mL，室溫放置20min后，進行存活率的檢測，每種試劑篩選出1個適宜的劑量，該適宜劑量應為蟲體被較好的麻醉且存活率較高。在該適宜劑量的處理中吸取狀態良好的個體置于顯微鏡下進行觀察，確定伸縮泡和收集管的觀察效果。

2.2 伸縮泡簡易觀察法 吸取尾草履蟲培養液（蟲體密度大時效果較好）1滴于清潔的載玻片上，待液滴稍散開時，在液滴中部滴加少許用培養液配制成的2%美蘭染液。如較難控制滴加量時可用解剖針等蘸取少許染色液溶于培養液滴中部，待染色液滴稍散開但未擴散均勻時，制成草履蟲臨時裝片。

2.3 伸縮泡觀察裝片蓋片支撐物的選擇 選擇5種常用支撐物進行常規壓片，對其封片和觀察效果進行檢測，篩選出適用于觀察伸縮泡裝片制作的適宜支撐物。

3 結果與分析

3.1 5種化學試劑對尾草履蟲存活率的影響 根據方法2.1測定5種化學試劑（5個梯度）對尾草履蟲存活率的影響，其結果如表1所示。由表1可知，5種化學試劑均得到了存活率較高的濃度，分別為1.5%石碳酸品紅、2.0%的美蘭染色液、0.5%的醋酸溶液、0.25%的戊巴比妥鈉和0.5%的乙醇。

3.2 5種化學試劑適宜劑量處理尾草履蟲后觀察伸縮泡的效果 按照方法2.1篩選出適宜劑量，對適宜劑量處理的細胞進行觀察，其結果如表2所示。由表2可知，2.0%的美蘭染液、0.5%的醋酸溶液和0.5%的乙醇溶液處理后，可在鏡下觀察到伸縮泡，其中美蘭染液組的伸縮泡較為清晰，收集管可見度高，收集管活動頻率較易計數，本實驗計數為17次/min。這種狀態的維持時間為19min，對于課堂教學的觀察時間較為充裕。

3.3 觀察結果 根據方法2.2，應用2.0%的美蘭溶液對草履蟲進行處理后，置于顯微鏡下進行觀察，觀察結果表明：在鏡下尋找處于不動狀態但并未死亡的蟲體，在細胞前后部找到伸縮泡（圖1的1～3），此時將物鏡轉為高倍進行仔細觀察，可清晰的看到伸縮泡和收集管的交替活動（圖1的4～6）。滴加染色液后待液滴未均勻時進行壓片可在小范圍內形成1個劑量梯度，劑量大的位置蟲體被較深麻醉甚至殺死，劑量較小的位置蟲體麻醉程度小或仍可處于自由活動狀態，這2種狀態均不利于伸縮泡的觀察，但這2種狀態的中間位置可找到蟲體處于適度麻醉而胞器活動正常的個體。裝片制成片刻后，美蘭染色液即可適量滲入伸縮泡，在顯微鏡下呈現極淺的藍色，將視野略加調暗，觀察效果十分理想。此種方法觀察伸縮泡正常活動時程較長，可達20min以上，適于實驗課堂操作。時間過久后染色液逐漸擴散均勻導致伸縮泡過度膨脹，最終解體。

3.4 4種臨時裝片支撐物的使用結果 根據方法2.3選取5種蓋玻片支撐物，制作臨時裝片后，對支撐物的效果進行檢測，其結果如表1所示。由表3可知：支撐力較強的尾棉花和10%甲基纖維素；甲基纖維素的溶解速度較膠水和漿糊慢；蓋片距離的精確控制力方面僅有10%的甲基纖維素效果最好。

4 討論

原生動物為實驗教學和科學研究中常用的實驗動物，尾草履蟲作為常規實驗教學的材料具有較多優勢：易于采集和培養，細胞核小核個體大，染色和觀察操作簡單等。伸縮泡是原生動物的重要胞器，行使水分調節和代謝廢物的排出等功能，為使理論課堂的知識得以鞏固，實驗教學中應進行更詳細的觀察和講解，但伸縮泡的觀察效果一直不盡人意，尤其是實驗課堂時間短，學生操作不熟練等。伸縮泡未能得到較好觀察的主要原因如下：（1）該細胞器為膜泡狀組成，在活體中不易觀察；（2）活動的規律性較強，如用一般染料進行固定后觀察不到其動態過程；（3）位置深埋于細胞質中。為使學生更好地掌握這個器官的特點，本實驗專門針對該問題進行了探討，尋找出一種較為適用于課堂的觀察方法，將細胞處理后處于既未死亡又不運動的麻醉狀態進行觀察，應用美蘭染色液處理效果比較理想。該方法得以成功使用的前提是具備一定的臨時裝片制備技術，尤其是蓋玻片支撐物的選擇，10%的甲基纖維較為適用。

參考文獻

[1]李力，謝娟英.培養液對尾草履蟲種群增長和個體形態的影響[J].西北大學學報，2004，3：314-316.

[2]楊仙玉.教學中草履蟲活體觀察方法[J].中國科教創新導刊，2010，2：88-89.

[3]唐發輝，趙元莙，汪婷.食物泡在草履蟲體內移行現象與伸縮泡頻率的相關研究分析[J].教育教學論壇，2015，8：67-68.

[4]J.Venkateswara Rao，S.K.Arepalli，V.G.Gunda，et al.Assessment of cytoskeletal damage in Paramecium caudatum：An early warning system for apoptotic studies[J].Protist，2018，6：205-219.

[5]高晶.尾草履蟲、尾柱蟲和魏氏擬尾柱蟲形態、細胞內部及表膜下結構的觀察[D].哈爾濱：哈爾濱師范大學，2012.

[6]楊仙玉.觀察草履蟲細胞核的兩種染色方法[J].科技創新導報，2010，3：240.

（責編：張宏民）