烏飯樹葉中粗黃酮的提取及抗氧化性研究

滿洋　劉富康　曲映紅

摘 要：以80%乙醇溶液浸提干燥的烏飯樹葉，用分光光度法測定提取液中的粗黃酮含量。在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優化了烏飯樹葉粗黃酮的提取工藝。結果表明，粗黃酮最佳提取條件為：提取時間2h、提取溫度80℃、料液比1∶15，提取率最高達2.79%。抗氧化試驗的結果顯示烏飯樹葉粗黃酮有較高的DPPH自由基清除能力，是一種良好的天然抗氧化劑。

關鍵詞：烏飯樹葉；黃酮；提取工藝；抗氧化性

中圖分類號 R284.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）19-0015-03

Study on Extraction and Antioxidant Activity of Crude Flavonoids from Vaccinium bracteatum Thunb. Leaves

Man Yang et al.

（Shanghai Ocean University，National Experimental Teaching Demonstration Center for Food Science and Engineering，Shanghai 201306）

Abstract：In this study，crude flavonoids was extracted from Vaccinium bracteatum Thunb. leaves with 80% ethanol and its content was determined by spectrophotometry. On the basis of single factor experiment，the extraction process of crude flavonoids from Vaccinium bracteatum Thunb. leaves was optimized by orthogonal test. The optimum extraction conditions were as follows：the extraction time was 2h，the extraction temperature was 80℃，the solid-liquid ratio was 1：15，the extraction rate of flavonoids was 2.79%. The result of antioxidant activity experiment showed that the crude flavonoids has high DPPH free radical scavenging capacity.Vaccinium bracteatum Thunb.leaves is a good source of natural antioxidants.

Key words：Vaccinium bracteatum Thunb.leaves；Flavonoids；Extraction technology；Antioxidant activity

烏飯樹又名南燭，因江南地區的人們有用其葉蒸烏飯食用的習俗而得名，屬杜鵑花科常綠灌木，主要分布于長江以南各省區。藥用歷史悠久，其葉汁含有天然黑色素，具有松弛血管、改善血液循環的作用，也可以預防動脈硬化、糖尿病等[1]。烏飯樹葉提取物主要以黃酮類和多酚類為主，還含有少量的維生素、糖類、蛋白質等其他成分[2]。有資料顯示烏飯樹葉的黃酮類提取物具有一定的抗氧化作用[3-4]。本文研究了烏飯樹葉粗黃酮提取物對DPPH自由基的清除能力，旨在為開發綠色安全的天然抗氧化劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 烏飯樹葉：2016年11月購于湖北武漢。試劑：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），乙醇，蘆丁，抗壞血酸，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉等，所用試劑均為分析純。儀器：AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LLJ-306Z粉碎機，江門市貝爾斯頓電器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；KQ5200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10臺式冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司；752N分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗黃酮含量的測定 參照王芳和LONDONO[5-6]的方法，并做些許改動。準確稱取40mg蘆丁，用80%乙醇溶解，定容至50mL容量瓶中。取5個25mL比色管，分別加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL蘆丁溶液，各管中加入3.0mL80%乙醇溶液和0.5mL5%亞硝酸鈉溶液，混勻后靜置6min，加入0.5mL10%硝酸鋁溶液，混勻后靜置6min，再加入4.0mL5%氫氧化鈉溶液，混勻后靜置15min，用80%乙醇定容，以未加入蘆丁標準溶液的1管作空白對照，測定波長510nm處的吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。精確稱取10g粉碎并烘干的烏飯樹葉，80%乙醇超聲浸提，5000r離心5min，將上清液旋轉蒸發去除溶劑后，轉移至100mL容量瓶中用80%乙醇定容，得到烏飯樹葉粗黃酮提取液，按上述方法測定其吸光度，根據標準曲線計算粗黃酮得率。

1.2.2 烏飯樹葉粗黃酮提取工藝優化 通過單因素試驗分別考察提取時間（1、1.5、2、2.5h）、提取溫度（50、60、70、80℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）3個因素對烏飯樹葉提取物中粗黃酮得率的影響。在單因素試驗的基礎上，采用L9（33）正交試驗，以烏飯樹葉提取物中粗黃酮的得率為考察指標，對提取時間、料液比和提取溫度3個影響因素進行綜合考察，進一步優化烏飯樹葉中粗黃酮的提取工藝條件。正交試驗設計結果如表1所示。

1.2.3 烏飯樹葉提取物抗氧化性測定（DPPH法） 按1.2.2中正交試驗獲得的最佳提取工藝進行浸提，離心后的上清液減壓濃縮后，冷凍干燥獲得烏飯樹葉粗黃酮提取物。將濃度分別為20mg·L-1，25mg·L-1，30mg·L-1，35mg·L-1，40mg·L-1，45mg·L-1的粗黃酮和Vc系列溶液按照勾明玥和方敏[7-8]的實驗方法，測定樣品和空白反應混合物在517nm處的吸光度，根據下列公式計算清除率：

K（%）=[1-（A1–A2）/A0]×100

式中，K為樣品對DPPH自由基的清除率，A1為DPPH溶液加樣品液后的吸光度，A2為樣品液在測定波長的吸光度，A0為DPPH溶液不加樣品液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線 經線性回歸得出蘆丁濃度與吸光度值關系曲線的回歸方程為y=0.026x+0.001，R2=0.999。該方法線性關系良好，可以用來測定烏飯樹葉提取物中粗黃酮的得率。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取時間對粗黃酮得率的影響 由圖1可知，從0.5h開始，隨提取時間的增加，粗黃酮的得率隨之上升，當提取時間達到1.5h時，得率達到最高；繼續延長提取時間，粗黃酮的得率反而下降，這可能是由于已溶出的粗黃酮在持續高溫條件下遭到破壞所致[9]。

2.2.2 料液比對粗黃酮得率的影響 由圖2可以看出，隨著溶劑使用量的增加，粗黃酮的得率也隨之升高。料液比為1∶20時，粗黃酮的得率達到最高，再增加溶劑量，得率下降。這可能是由于溶劑繼續增加時，導致了其他脂溶性物質的增多[10]，不利于粗黃酮的提取。

2.2.3 提取溫度對粗黃酮得率的影響 由圖3可知，粗黃酮的得率隨提取溫度的升高而增大。當溫度為80℃時，得率達到最大，這可能是由于溫度升高，分子運動加快，從而使黃酮的溶解度不斷增大；高溫條件下細胞膜易破損，有利于粗黃酮從組織細胞轉移到提取溶劑中[11]。

2.3 正交試驗結果 由單因素試驗得到最好的3個水平分別為提取溫度：60、70、80℃；提取時間：1、1.5、2h；料液比：1∶15、1∶20、1∶25，按照正交試驗設計表進行正交試驗，結果如表2所示。由表2可知，最佳的提取工藝為A3B3C1，即提取溫度80℃，提取時間2h，料液比1∶15時烏飯樹葉提取物中粗黃酮得率最高。通過表2的極差R分析，三者對粗黃酮得率的影響度為A>C>B，即提取溫度>料液比>提取時間。

在A3B3C1的最佳提取工藝條件下進行驗證試驗，結果表明：重復提取3次，粗黃酮得率平均值為（2.79±0.01）%，因此正交試驗的結果是準確和穩定的。

2.4 抗氧化性試驗結果 由圖4可以看出，烏飯樹葉粗黃酮對DPPH自由基的清除率隨濃度的提高而上升，雖然低于相同濃度Vc對DPPH自由基的清除率，但依然達到了70%以上的較高水平。

3 結論

采用正交試驗優化烏飯樹葉中粗黃酮的提取工藝，得到最佳的提取條件為提取時間2h、提取溫度80℃、料液比1∶15，該條件下粗黃酮的最大得率為2.79%。

烏飯樹葉粗黃酮具有較高的DPPH自由基清除率，是一種良好的天然抗氧化劑，值得進一步開發利用。

參考文獻

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[2]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草（第6卷）[M]. 上海：上海科學技術出版社，1998：45-47.

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[6]LONDONO J，DE LIMA V R，LARA O，et al. Clean recovery of antioxidant flavonoids from citrus peel：Optimizing an aqueous ultrasound-assisted extraction method[J]. Food Chemistry，2010，119（1）：81-87.

[7]勾明玥，劉梁，張春枝.采用DPPH法測定26種植物的抗氧化活性[J].食品與發酵工業，2010（36）：148.

[8]方敏，王耀峰，宮智勇.15種水果和33種蔬菜的抗氧化活性研究[J].食品科學，2008，29（10）：97.

[9]PENG L X，ZOU L，ZHAO J L，et al. Response surface modeling and optimization of ultrasound-assisted extraction of three flavonoids from tartary buckwheat （Fagopyrum tataricum）[J]. Pharmacognosy Magazine，2013，9（35）：210-215.

[10]扶慶權，侯佩，陳能.響應面法優化蘆蒿葉總黃酮的提取工藝[J].食品科學，2013，34（4）：94-98.

[11]KONG K W，ISMAIL A R，TAN S T，et al. Response surface optimization for the extraction of phenolics and flavonoids from a pink guava puree industrial by-product[J]. International Journal of Food Science and Technology，2010，45（8）：1739-1745.

（責編：張宏民）