云南地區漢族脊髓小腦共濟失調3型SCA3/MJD患者的臨床特點及遺傳學研究

張林明 李陶樂 段尉梅 張玉林 陳玲 戴淑娟 艾青龍 徐忠

[摘要] 目的 通過對云南地區臨床診斷為脊髓小腦共濟失調的家系進行SCA3基因檢測，探討漢族人群遺傳性脊髓小腦共濟失調3型（spinocerebellar ataxia type 3，SCA3）患者臨床特點與遺傳學特征。 方法 對4個家系26例脊髓小腦共濟失調患者進行神經系統檢查和家系譜調查，應用聚合酶鏈反應（PCR）、瓊脂糖凝膠電泳和基因測序等技術進行 SCA3 基因內CAG三核苷酸重復序列，并對異常等位基因片段進行DNA測序。 結果 臨床表現以共濟失調和構音障礙為主，其次表現為錐體束征、眼部癥狀等，認知功能障礙較少見。檢出4個家系（26例患者）為SCA3，符合常染色體顯性遺傳特點，測序證實其異常等位基因CAG重復數目在67～82次之間。 結論 云南地區漢族的SCAs患者以SCA3型為主，主要表現為共濟失調和構音障礙，基因檢測仍是其診斷的金標準。

[關鍵詞] 漢族；脊髓小腦共濟失調3型；體征和癥狀；基因型；三核苷酸重復擴增

[中圖分類號] R744.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）27-0004-03

[Abstract] Objective To investigate the clinical characteristics and genetic characteristics of patients with hereditary spinocerebellar ataxia type 3（SCA3） in Han population by SCA3 gene detection in the family of clinical diagnosis of spinal cord cerebellar ataxia in Yunnan. Methods Neurological examination and family pedigree survey were performed on 26 patients with spinal cord cerebellar syndrome in 4 families. Polymerase chain reaction（PCR）， agarose gel electrophoresis and gene sequencing were used to carry out CAG trinucleotide repeats in SCA3 gene. And DNA sequencing of abnormal allelic fragments was performed. Results The clinical manifestations were mainly ataxia and dysarthria， followed by pyramidal tract signs and eye symptoms. Cognitive dysfunction was less common. 4 families（26 patients） were detected as SCA3， consistent with autosomal dominant inheritance. Sequencing confirmed that the number of abnormal allele CAG repeats was between 67 and 82 times. Conclusion SCA3 type is the main type of SCAs in Han nationality in Yunnan， mainly characterized by ataxia and dysarthria. Genetic testing is still the gold standard for diagnosis.

[Key words] Han nationality； Spinal cerebellar ataxia type 3； Signs and symptoms； Genotype； Trinucleotide repeat amplification

脊髓小腦性共濟失調（spinocerebellar ataxia，SCA）是一組以共濟失調為主要表現的神經系統變性疾病，伴隨有眼球活動障礙、錐體束受損、周圍神經病及認知功能障礙等癥狀[1]，以常染色體顯性遺傳為主，該類疾病各亞型臨床表現復雜，癥狀間存在交叉，因此臨床分型及鑒別診斷十分困難。1992年Volz首次報道了脊髓小腦性共濟失調1型（SCA-1）的基因位點，從此開啟了對SCAs的基因診斷和發病機制的研究，目前為止發現約40余種亞型[2]，SCA3/MJD（又稱馬查多-約瑟夫病，Machado-Joseph disease，MJD）是最常見的亞型[3]。1994年Kawaguchi發現該基因定位于常染色體14q32.1，該基因10號外顯子區的（CAG）n異常重復擴增是該病的遺傳學病因[4]。為了解云南地區SCA3/MJD患者是否具有獨特的臨床特點與遺傳學特征，我們對4個云南地區漢族SCA家系進行檢測和分析，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇昆明醫科大學第一附屬醫院和云南省第三人民醫院神經內科收集的共4個家系26例患者（男14例，女12例，平均年齡39.2±4.2歲）和7例“健康”家系成員（即無臨床癥狀的家系成員，男4例，女3例，平均年齡33.0±5.7歲），均為漢族，所有家系均來自云南各地州。臨床診斷依據Harding標準[5]。另選擇同期在昆明醫科大學第一附屬醫院和云南省第三人民醫院體檢中心進行體檢的30例正常人（男15例，女15例，平均年齡38.2±5.1歲，漢族，無家族遺傳病史，與上述家系均無血緣關系，神經系統查體無陽性體征）作為對照組。

1.2研究方法

1.2.1 外周血DNA提取 抽取SCAs患者、“健康”家系成員和正常對照組外周血4 mL，采取標準酚/氯仿抽提法提取DNA作為PCR模板。

1.2.2 PCR擴增 根據文獻[6]合成引物：SCA3-F：5-CCAGTGACTACTTTGATT CG-3；SCA3-R：5-TGGCCTT TCACATGG ATGTGA A-3。25 μL反應體系：10×PCR Burffer 2.5 μL，20 mmol/L mg2+1.875 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，Taq酶（5U/μL）0.2 μL，Primers（0.1 μg/μL）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR 擴增：95℃預變性5 min，94℃變性40 s；不同退火溫度55℃退火40 s；72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min；4℃保存；共30個循環。PCR產物檢測：使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后在自動凝膠成像系統上觀察結果。

1.2.3毛細管電泳片段分析 使用Genescan軟件分析結果，CAG重復拷貝數=[DNA片段長度（bp）-側翼區長度（bp）]/3。

1.2.4 DNA 將純化后的PCR產物與PMD-19T載體16℃，60min連接反應；取10 μL連接產物轉化克隆；取陽性克隆進行菌液PCR鑒定，提取質粒后利用AB1377測序儀測序，測序結果序列對比使用NCBIBlast完成。

1.3統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，在相關性分析中，資料符合正態分布，采用Pearson相關分析，否則采用 Spearman 相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 SCA3/MJD患者的臨床特點

4個家系的26例患者，男14例，女12例，發病年齡20～53（39.5±5.3）歲，病程2～19年，符合常染色體顯性遺傳特征。所有患者均有程度不等的共濟失調和構音障礙，其次表現為錐體束征17例（65%），眼外肌麻痹13例（50%），感覺障礙12例（46%），眼球震顫9例（34%），認知功能障礙較少見有4例（15%）。

2.2 SCA3/MJD的基因診斷

SCA3/MJD基因診斷標準為CAG重復次數≥62次，檢測結果顯示，4個家系中有26例患者達到這一標準，可以診斷為SCA3/MJD患者，CAG重復次數為67～82（74.1±5.8）次；癥狀前患者7例（男4例，女3例）突變等位基因CAG重復次數為62～80（67.2±6.8），正常對照組CAG重復次數為14～46（38.4±2.1）（圖1）。

2.3 SCA3/MJD臨床癥狀與CAG重復次數的關系研究

2.3.1 發病年齡與CAG重復次數的相關性 26例SCA3/MJD患者的發病年齡與CAG重復次數有顯著的負相關性，Pearson相關系數r=1.241，P<0.01，CAG重復次數越多，發病年齡越早。

2.3.2 SARA評分與CAG重復次數的相關性 26例SCA3/MJD患者的SARA評分與CAG重復次數無相關性，Pearson相關系數r=0.248，P>0.05。

3討論

脊髓小腦性共濟失調各亞型臨床表現復雜，具有高度的臨床變異性和遺傳異質性。Tang B等[7]研究表明，SCA3/MJD是中國最普遍的類型，我們研究的4個家系均為SCA3，進一步驗證了該結論。

SCA3/MJD臨床表現復雜，分為4種亞型[8]：1型小腦癥狀不明顯或較輕，可有面、舌部肌束震顫和突眼，多于45歲左右死亡；2型20～45歲發病，有明顯的小腦及錐體系或椎體外系癥狀，病情較輕，死亡年齡約60歲；3型40～60歲發病，表現為小腦癥狀及遠端肌肉無力，感覺減退，深反射低下或消失，病情進展較慢；4型以帕金森癥狀為特點。本研究中報道的病例發病年齡20～53歲，所有患者均有共濟失調和構音障礙，以2、3型為主，但病例數較少，需進一步擴大樣本量，以便發現SCA3/MJD的其他亞型。

目前報道的SCA3/MJD患者CAG重復次數存在一定差異：國外的報道次數61～89次不等，其中最低為45次[9]；國內不同地區存在差異：寧夏地區為66～81次[10]，廣西地區為68～78次[11]，重慶地區為58～71次[9]，河南地區為70～79次[12]，國內最低為43次。本研究中云南地區漢族SCA3/MJD患者CAG的重復次數67～82次，癥狀前患者為62～80次，與國內研究基本一致。

SCA3/MJD具有遺傳早現現象，其基礎是CAG重復次數在代間的不穩定擴增的結果，下一代CAG的重復次數較上一代增多，本研究中發現云南地區漢族SCA3/MJD患者的發病年齡與CAG重復次數呈顯著負相關，CAG重復次數越多，發病年齡越早，與國內外報道一致[11，13]。本研究中發現4個家系中均存在下一代較上一代發病年齡提前、病情嚴重的情況。

Shang-Ran Huang[14]在研究中發現CAG重復次數與患者SARA評分無統計學意義，這與本文研究一致；在研究脊髓小腦性共濟失調方面，國際協作共濟失調評估量表（ICARS）與SARA評分都用來評估患者共濟失調的嚴重程度，顧衛紅等[15]在其類似研究中發現，ICARS評分與CAG重復次數無關，但與患者的病程顯著相關；Carlos等[16]研究發現SARA評分與灰質體積呈負相關，這些前期的研究成果提供更廣泛的思路，我們將進一步收集病例，研究病程、灰質體積、SARA評分間相互關系。

本研究發現，脊髓小腦性共濟失調亞型眾多，臨床表型復雜，通過基因檢測可以做出準確的診斷，云南地區脊髓小腦性共濟失調以SCA3/MJD為主，這為我們進一步研究該類型疾病的發病機制和治療方法奠定基礎。

[參考文獻]

[1] 劉鈺鵬，田增民.脊髓小腦性共濟失調的基因研究進展[J].醫學綜述，2013，19（15）：2722-2725.

[2] Coutelier M，Blesneac I，Monteil A，et al. A Recurrent Mutation in CACNA1G Alters Cav3.1 T-Type Calcium-Channel Conduction and Causes Autosomal-Dominant Cerebellar Ataxia[J]. Am J Hum Genet，2015，97：726-737.

[3] 崔海燕，李旭光，朱敏霞，等.脊髓小腦性共濟失調的研究進展[J].醫學綜述，2011，17（19）：2958-2960.

[4] Kawaguchi Y，Okamoto T，Taniwaki M，et al. CAG expansionsin a novelgene for Machado-Joseph disease at chromosome14g32.1[J].Natgenet，1994，8（3）：221-228.

[5] Harding AE.Clinical features and classification of inherited ataxias[J]. Adv Neurol，1993，61（1）：1-14.

[6] Schls L，Bauer P，Schmidt T，et al. Autosomal dominant cerebellar ataxias：Clinical features，genetics，and pathogenesis[J].Lancet Neurol，2004，3（5）：291-304.

[7] Tang B，Liu C，Shen L，et al.Frequencyof SCA1，SCA2，SCA/MJD，SCA6，SCA7，and DRPLA CAG trinucleotide repeat expansion in patients with hereditary spinocerebellar ataxia from Chinese kindreds[J].Arch Neurol，2000， 57（4）：540-544.

[8] Coutinho P，Andrade C. Autosomal dominant system degeneration in Portuguese families of the Azores Islands.A new genetic disorder involving cerebellar，pyramidal，extrapy ramidal and spinalcord motor functions[J].Neurology，1978，28（7）：703-709.

[9] 張鳳娟，郭洪，陳陽美，等.重慶地區脊髓小腦共濟失調的臨床特征分析與分子遺傳學研究[J].第三軍醫大學學報，2015，37（7）：693-697.

[10] 楊笑，范學文，王進，等.寧夏地區回、漢族脊髓小腦共濟失調家系SCA3/MJD 基因突變研究[J].中國現代神經疾病雜志，2008，8（6）：556-560.

[11] 羅曼，肖友生，甘露.廣西地區脊髓小腦性共濟失調3型/Machado-Joseph病患者的基因診斷及臨床特征分析[J].廣西醫科大學學報，2012，29（4）：520-522.

[12] 李學，王澤帥，馬建軍.河南地區遺傳性脊髓小腦共濟失調3型患者臨床特征及分子生物學的研究[J].臨床薈萃，2010，25（14）：1197-1200.

[13] D'Abreu A，France MJ，Paulson HL，et al.Caring for Machado-Joseph disease：Current understanding and how to help patients[J].Parkinsonism Relat Disord，2010，16（1）：2-7.

[14] Shang-Ran Huang，Yu-Te Wua，Chii-Wen Jao，et al. CAG repeat length does not associate with the rate of cerebellar degeneration in spinocerebellar ataxia type 3[J].NeuroImage： Clinical，2017，（13）：97-105.

[15] 顧衛紅，王國相，王康.脊髓小腦共濟失調3型 ICARS 評分相關因素分析[J].中國現代神經疾病雜志，2008，2（8）：139-141.

[16] Carlos R，Hernandez-Castillo，Rosalinda Diaz，et al. Neural correlates of ataxia severity in spinocerebellar ataxia type 3/MachadoJoseph disease[J]. Cerebellum & Ataxias，2017，（4）：7.

（收稿日期：2017-09-28）