miR-93在食管鱗癌組織和細胞中的表達變化及臨床意義

宋衛敏,劉新磊,董玉娟,任傳濤

(1濰坊醫學院附屬益都中心醫院，山東青州262500；2德州市人民醫院)

食管癌是最常見的高度惡性腫瘤，西方歐美國家以食管腺癌為主，而在中國等亞洲國家以食管鱗癌為主[1]。食管癌往往發現較晚，雖然目前手術及放化療等治療手段不斷改進，但由于延誤診斷和高復發率，食管癌患者的5年生存率仍然較低[2，3]。至今，食管癌的病因及發展機制尚不明確，仍缺少有效的分子標志物和靶向治療靶點，因此從分子水平闡明食管癌發生、轉移的分子機制，尋找特定有效的分子靶向治療靶點，建立有效的早期診斷、精確評估、判斷預后的新方法具有重大意義。微小核糖核酸(miRNA)是一類長度在19～22個核苷酸的內源性、高度保守的單鏈非編碼小RNA，可以通過靶向結合目標mRNA的3′非翻譯區(3′-UTR)，在轉錄后水平抑制靶基因的表達，從而發揮其生物學功能[4，5]。近年研究證實，miRNA在細胞增殖、凋亡、發展和分化中起著重要調控作用，并與腫瘤的發病、進展及預后關系密切[6，7]。miR-93是近期發現的miRNA家族重要成員之一，屬于miR-106b-25 miRNA簇成員。目前研究發現，miR-93在許多惡性腫瘤組織中表達異常，在惡性腫瘤的發生發展中起著重要作用[8]。但目前有關miR-93在食管鱗癌中表達情況的研究甚少。2017年11月～2018年4月，本研究通過qRT-PCR法檢測食管鱗癌細胞系和正常食管細胞系、食管鱗癌組織和癌旁組織中miR-93的表達情況，并進一步分析其與患者臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞及組織：人食管鱗癌細胞系KYSE410、ECA-109、KYSE-510和人食管正常細胞系Het-1A均購自中國科學院上海細胞研究所。細胞均置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，于37 ℃、含5% CO2的培養箱中常規培養。濰坊醫學院附屬益都中心醫院和德州市人民醫院手術切除的食管鱗癌組織和對應的癌旁組織(距離腫瘤邊緣至少5 cm)新鮮標本110例份，組織標本在離體30 min內生理鹽水清洗后置入液氮中，轉入-80 ℃冰箱中保存備用。患者術前均未進行放、化療及生物免疫治療等任何抗腫瘤治療，并且未合并其他器官的惡性腫瘤。手術后標本均經病理檢查證實為鱗狀細胞癌。110例份組織中，患者男78例，女32例；年齡>60歲84例，≤60歲26例；腫瘤直徑>5 cm 65例，腫瘤直徑≤5 cm 45例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期60例，Ⅲ期50例；腫瘤位置：上段13例，中下段97例；有淋巴結轉移71例，無淋巴結轉移39例。患者均簽署知情同意書，并經醫院醫學倫理委員會批準。試劑及儀器：TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-93及內參U6引物購自廣州銳博生物技術公司；LightCycle 96熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司；胎牛血清、RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；細胞培養箱購自美國Thermo公司。

1.2 組織或細胞miR-93表達的檢測 采用qRT-PCR法。嚴格按照TRIzol試劑盒說明書操作提取組織或細胞總RNA，分光光度計檢測提取的RNA純度和濃度，以吸光度(A)值A260nm/A280nm在1.9～2.0范圍內的RNA作為合格標準用于后續實驗。取總RNA,參照逆轉錄試劑盒說明書操作逆轉錄cDNA。以cDNA為模板，利用qRT-PCR試劑盒及特異性引物進行實時熒光定量PCR反應。miR-93引物序列：上游引物：5′-AGTCTCTGGGCTGACTACATCACAG-3′，下游引物：5′-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3′；U6引物序列：上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，共40個循環。以U6作為內參照計算miR-93的相對表達量，相對表達量數值采用2-ΔΔCt法計算。

2 結果

2.1 miR-93在食管鱗癌細胞系和食管正常細胞系中的表達 KYSE410、ECA-109、KYSE-510、Het-1A中miR-93的相對表達水平分別為1.01±0.05、5.18±0.23、4.39±0.21、3.36±0.28。與人食管正常細胞系Het-1A相比，人食管鱗癌細胞系KYSE410、ECA-109、KYSE-510中miR-93的表達水平升高(P均<0.01)。見圖1。

2.2 miR-93在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達 miR-93在食管鱗癌組織和相對應的癌旁組織中相對表達水平分別為1.03±0.07、7.45±0.45。與癌旁組織相比，食管鱗癌組織中miR-93的表達水平升高(P均<0.01)。見圖2。

2.3 miR-93表達與食管鱗癌患者臨床病理參數的關系 以miR-93的均值水平為界值，將患者分為miR-93高表達(≥7.45)組58例和miR-93低表達(<7.45)組52例。miR-93的表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM分期密切相關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤位置無關(P均>0.05)。見表1。

圖1 miR-93在食管鱗癌細胞系和食管正常細胞系中的表達

注：與Het-1A相比，*P<0.01。

圖2 miR-93在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達

表1 miR-93表達與食管鱗癌患者臨床病理參數的關系(例)

2.4 miR-93表達與食管鱗癌患者預后的關系 Kaplan-Meier分析結果顯示，miR-93高表達患者預后較差(P<0.01)，見圖3。Cox多因素回歸分析結果顯示，淋巴結轉移、TNM分期、miR-93表達是影響患者預后的獨立危險因素(P均<0.05)。見表2。

圖3 食管鱗癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

表2 食管鱗癌患者預后的Cox回歸分析

3 討論

近年，雖然食管癌的手術及藥物治療取得了一定發展，但食管癌預后仍然較差，食管癌的局部復發及轉移是目前制約患者治療效果，影響其生存期進一步提高的主要瓶頸之一。目前食管癌的發生發展機制尚不完全明確，尚無有效的靶向治療藥物。

研究發現，miRNA在多種癌癥中表達異常，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及遷移方面起著重要作用，已成為目前腫瘤研究及基因治療的熱點問題[9]。在食管癌方面，已經證實有許多miRNA參與食管癌的發生、發展、侵襲及轉移等[10,11]。miR-93屬于miR-106b-25 miRNA簇(miR-106b、miR-93、miR-25)成員之一。既往研究表明，miR-93在眾多不同的惡性腫瘤組織中均出現表達水平異常，如在胃癌[12]、肝細胞癌[13]、子宮內膜癌[14]、骨肉瘤[15]中表達增強，而在結腸癌[16]、乳腺癌[17]等中表達受到抑制，但其具體功能尚不清楚。miR-93在不同腫瘤中可能作用于不同的靶基因，從而起著不同的作用。目前，有關miR-93在食管鱗癌中表達情況的研究甚少。本研究通過qRT-PCR檢測了110例份食管鱗癌組織和相對應的癌旁組織，人食管鱗癌細胞系KYSE410、ECA-109、KYSE-510和人食管正常細胞系Het-1A中miR-93的表達水平后發現，miR-93在食管鱗狀組織和細胞中表達異常增高；并且進一步統計分析發現，miR-93的表達與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移及TNM分期密切相關，提示miR-93的表達水平異常與食管鱗癌的發生發展及轉移密切相關。

目前，有關miR-93與惡性腫瘤患者預后關系的研究較少。已有研究報道，在頭頸部鱗癌[18]、胃癌[19]中miR-93的高表達與患者的不良預后相關。本研究中我們通過對食管鱗癌患者進行了術后隨訪，也發現miR-93高表達組患者預后較差。同時我們進一步通過多變量Cox回歸模型分析顯示，miR-93高表達是影響患者預后的獨立危險因素，提示miR-93可以作為判斷食管鱗癌預后的分子生物學標志物。

綜上所述，食管鱗癌中miR-93表達異常增高，其異常高表達與腫瘤的發生發展有關，并且是影響患者預后的獨立危險因素，本研究為食管鱗癌的靶向治療以及預后預測提供了新的方向。