血清miR-374a在宮頸癌患者中的表達變化及其與臨床病理特征的關系

亓穎芝,郎曉艷,周靜,李春鳳,李靜,蘆鑫

(山東大學第二醫院,濟南250033)

宮頸癌是一種女性常見惡性腫瘤[1]。近年，我國宮頸癌發病率和病死率明顯上升。miRNA是一類大小為18～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA，通過與mRNA的非編碼區3′UTR相互結合，來發揮對靶mRNA的降解或抑制其翻譯[2]，其廣泛分布于血清、尿液、腦脊液等體液中，且穩定存在。有文獻[3]報道，miR-374a在結腸癌中表達水平較癌旁組織明顯上調[4]；其在非小細胞肺癌中的表達也明顯升高；Cai等[5]發現，miR-374a可以激活Wnt/β-catenin分子通路，進而促進乳腺癌的侵襲轉移。因此，推測miR-374a可能在腫瘤發生發展中發揮重要作用。但是目前關于miR-374a表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的相關性尚未見報道，本研究進行了相關探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年8月～2017年4月入住山東大學第二醫院婦科擬手術治療的宮頸癌患者68例，均經病理檢查確診。術前均未行化療、放療等其他治療。年齡33～65歲。病理分級：G1級20例、G2級33例、G3級15例；臨床分期按國際婦產科聯盟分期標準:Ⅰ期30例、Ⅱ期38例；組織類型：鱗癌40例、腺癌28例；有淋巴結轉移23例，無45例；根據是否感染人類乳頭瘤病毒(HPV)劃分:陽性50例，陰性18例;腫瘤直徑≥4 cm 23例，<4 cm 45例。選取體檢健康者36例作為對照組，年齡35～60歲。無宮頸部位的病變或者癌癥史。所有血液標本收集后置于-80 ℃低溫保存。

1.2 血清miR-374a的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(QRT-PCR)法。提取RNA：術前抽取宮頸癌患者靜脈血，總RNA于患者和正常體檢者血清中提取，提取方法按照天根miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書操作。提取后使用紫外分光光度儀檢測樣品的濃度與純度，進行后續試驗。合成cDNA：按照First Strand cDNA Synthesis Kit說明書加入反轉錄反應所需要的各種試劑，將總RNA進行逆轉錄合成cDNA。反應條件如下:16 ℃、15 min, 40 ℃、45 min,85 ℃、15 s。QRT-PCR：以逆轉錄產物為模板，按照SYBR Premix EX TaqTM試劑盒說明書操作，20 μL反應體系中加入miR-374a引物，在熒光實時定量PCR儀上進行擴增，其反應條件為:預變性95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個循環。U6-上游引物： 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;U6-下游引物：5 ′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。MiR-374a-上游引物：5 ′-TTATAATACAACCTGATAAGTG-3′；MiR-374a-下游引物： 5 ′-TGTCAACGATACGCTACGTAA-3′。采用相對定量方法對miRNA進行相對表達量計算，U6作為內參，以2-ΔΔCT法計算宮頸癌患者及健康對照者血清miR-374a表達水平。

2 結果

2.1 兩組血清中miR-374a的表達水平比較 宮頸癌組與對照組血清miR-374a相對表達水平分別為2.89±0.91、1.01±0.23。與對照組相比，宮頸癌組血清miR-374a表達水平升高(P<0.05)。

2.2 血清miR-374a表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 宮頸癌患者血清miR-374a表達水平與臨床分期、病理分級、是否存在淋巴結轉移密切相關(P均<0.05)；與患者年齡、宮頸癌組織學類型、是否HPV感染、腫瘤直徑無關(P均>0.05)。見表2。

表2 血清miR-374a表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的關系

3 討論

宮頸癌是最常見婦科惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤中發病率居第二位[6]。因此從分子水平對宮頸癌發病機制進行深入研究有助于發現新診療方法，提高宮頸癌的療效。宮頸癌患者血清中循環miRNA的表達譜與正常健康對照者相比有一定的差異，并且循環miRNA在血清中穩定且不易降解，有可能成為宮頸癌早期篩查及診斷的無創標志物。循環miRNA是胞外分泌的膜包裹顆粒非編碼小RNA，可以與蛋白質結合，也可以游離存在[7]。Nagamitsu等[8]研究宮頸癌患者血清中的miRNA，找出6個與正常對照組相比表達差異明顯的miRNA，進一步試驗后得出miR-483-5p、miR-1246、miR-1275和miR-1290可作為宮頸癌的診斷標記物。Wang等[9]發現，宮頸癌患者血清中miR-646、miR-141和miR-542-3p在手術前后表達有差異，推測這些miRNAs可成為宮頸癌術后復發監測的新指標。Jia等[10]同樣檢測宮頸癌患者和正常對照組血清中循環miRNA的表達水平，得出宮頸癌組有12個miRNA的表達量明顯升高。其中5種miRNA聯合檢測宮頸癌的特異性和靈敏度高于鱗狀細胞癌抗原(SCC)和CA125，推斷相對于SCC和CA125，血清中miRNAs診斷宮頸癌更有優勢。因此循環miRNAs可成為宮頸癌早期無創診斷的新腫瘤標志物，甚至有可能取代傳統非特異性的SCC和CA125等血清標志物。

miR-374a是位于X染色體上q13的miRNA。近年很多研究證實，miR-374a在許多腫瘤，如胃癌、肺癌、乳腺癌、膠質瘤中表達異常，并參與腫瘤的侵襲和轉移，發揮重要的基因調控作用。目前miR-374a在宮頸癌患者血清中的表達尚不清楚。本研究結果顯示，與對照組比較，宮頸癌組miR-374a表達水平升高，推測其可能參與宮頸癌的發生、發展。miR-374a有可能成為宮頸癌早期篩查及診斷的新標志物。

Xu等[11]研究發現，胃癌組織中miR-374a表達水平明顯升高，miR-374a可以促進胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力，該研究還得出miR-374a通過靶向C激酶信號抑制劑1而發揮作用。Cai等[5]研究發現，miR-374a在乳腺癌轉移細胞株中通過靶向WIF1、PTEN、WNT5A，激活Wnt/β-catenin信號，促進乳腺癌細胞上皮細胞間充質轉化和轉移；而且miR-374a在發生遠處轉移的乳腺癌患者中表達水平明顯升高，并與生存率密切相關，提示miR-374a在乳腺癌侵襲、轉移過程中發揮了重要作用。

本研究首次檢測了宮頸癌患者血清中miR-374a的表達水平，并進一步分析了miR-374a與宮頸癌患者各臨床病理特征之間的關系，miR-374a在宮頸癌不同臨床分期中的表達水平的差異有統計學意義，Ⅱ期患者血清中miR-374a的表達水平高于Ⅰ期患者；在有淋巴結轉移患者的相對表達水平高于無淋巴結轉移患者，G2～G3級宮頸癌患者中miR-374a的表達水平高于G1級患者，提示miR-374a可能為一種新的腫瘤標志物，并且miR-374a血清水平的高低可能有助于鑒別癌癥患者的臨床分期、病理分級、是否存在淋巴結轉移。由此推測miR-374a可能促進腫瘤細胞生長，與腫瘤促進因子作用相似。但是miR-374a在調控宮頸癌發生發展中具體分子機制仍不清楚，miR-374a調控靶基因信號通路有待于進一步研究。