Tiaml和E-cadherin在非肌層浸潤性膀胱癌組織中的表達及其與復發的關系

蘇宏偉，李婷，凌海濱，劉軍超，曹娟，李晨，劉鑫，李向東

(1河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000；2張家口市第二醫院)

膀胱癌是泌尿系最常見惡性腫瘤,在世界范圍，膀胱癌發病率占男性惡性腫瘤的第7位；在歐美，膀胱癌發病率占男性惡性腫瘤第4位；在我國，膀胱癌發病率占男性惡性腫瘤第7位，其中非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)占初發腫瘤70%[1]。NMIBC指腫瘤位于膀胱黏膜及固有層，未侵及肌層的膀胱癌，常采用保留膀胱的治療方式，如經尿道膀胱腫瘤電切術，術后輔以膀胱灌注化療；但術后有30%～50%患者可能出現復發，目前臨床上采用的分級分期方法很難準確預測其復發。尋找有效的分子標志物來早期、精確預測術后復發或進展是當前NMIBC的研究熱點[2]。我們采用免疫組化法探討T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1(Tiam1)、E鈣黏蛋白(E-cad)水平與NMIBC臨床特點的相關性,以期為臨床判斷預后提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取河北北方學院附屬第一醫院2005～2013年經病理證實且獲得隨訪的NMIBC患者116例，男71例、女45例,年齡37～82(56±7.63)歲。腫瘤單發67例，其中位于左側壁23例、右側壁21例、后壁18例、前壁5例，多發49例；腫瘤直徑0.5～3 cm，其中直徑≤2 cm 80例、>2 cm 36例，膀胱癌病理分級(WHO/ISUP, 1998):低分級(G1～G2) 85例,高分級(G3) 31例。另外，選取年齡與NMIBC患者相匹配的前列腺增生患者50例作為對照組。

1.2 NMIBC治療及隨訪 均采用經尿道膀胱腫瘤電切術。德國STORZ 30°電切鏡，術中甘露醇持續膀胱灌注，小于1 cm腫瘤予以整塊切除，大于1 cm腫瘤分次切除，切除范圍包括腫瘤及其周圍1 cm膀胱壁，切除腫瘤后常規切除肌層，分層送病理，術后病理證實無膀胱肌層浸潤。術后24 h內膀胱灌注表阿霉素(海正輝瑞公司)50 mg，保留40 min后排出，以后每周1次，8次后改為每月1次，共20次。術后前兩年每3個月復查膀胱鏡，2年后改為每半年復查1次，觀察腫瘤復發情況，術后隨訪均在5年以上。

1.3 膀胱癌及正常膀胱組織中Tiam1、E-cad表達的檢測 采用免疫組化SP法。鼠抗人Tiam1、E-cad單克隆抗體購自Santa Cruz公司。SP試劑盒購自北京中山生物制品有限公司。PBS液代替一抗作為陰性對照，已知胃癌陽性細胞作為陽性對照。收集NMIBC及前列腺增生患者恥骨上前列腺切除術中膀胱黏膜標本，以10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋后，切成厚度為4 μm的切片，首先進行HE染色，確定組織分化程度，然后再次切片，二甲苯和乙醇脫蠟水化，加入pH 7.4、濃度為0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高壓修復，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶。以非免疫血清封閉后，加入一抗孵育，4 ℃過夜，再加入二抗，孵育20 min。加入鏈霉菌素(辣根酶標記)溶液反應10 min，二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，常規脫水封片后，顯微鏡觀察每個組織的細胞著色情況，隨機選取5個視野。蛋白表達陽性判斷標準：Tiam1蛋白陽性染色為在細胞膜和細胞質中呈黃色或棕色顆粒，E-cad蛋白陽性染色為在細胞核或細胞質中呈黃色或棕色顆粒，邊界清楚，背景無明顯染色。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。膀胱癌不同蛋白表達與臨床參數間關系采用χ2檢驗，Tiam1、E-cad與膀胱癌組織與正常組織間表達比較采用Fisher’s精確概率法，Tiam1與E-cad之間相關性采用Pearson列聯系數，隨訪資料復發分析采用生存率曲線(Kaplan-Meier法)，用Log-rank檢驗判斷差異性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織Tiam1蛋白、E-cad蛋白表達比較 Tiam1在正常膀胱及NMIBC組織中均有表達，陽性細胞表現為細胞膜或細胞質內黃色或棕色顆粒；正常膀胱組織中Tiam1表達陽性率為14%(7/50)；NMIBC標本中,Tiam1表達陽性率為39.66%(46/116)；兩者比較差異有統計學意義(χ2=7.036，P<0.05)。E-cad在正常膀胱及NMIBC組織中均有表達，陽性細胞表現為細胞核或細胞質內黃色或棕色顆粒；正常膀胱組織中E-cad表達陽性率為10.00%(5/50)；NMIBC組織中,E-cad表達陽性率為63.79%(74/116)；兩者比較差異有統計學意義(χ2=6.603,P<0.05)。

2.2 癌組織中Tiam1、E-cad蛋白表達與NMIBC患者臨床病理特征的關系 癌組織中Tiam1蛋白表達與腫瘤病理分級、復發有關(P均<0.05)，與性別、腫瘤數目、腫瘤直徑無關(P均>0.05)；E-cad蛋白表達與腫瘤病理分級、復發有關(P均<0.05)，與性別、腫瘤數目、腫瘤直徑無關(P均>0.05)。見表1。

表1 癌組織中Tiam1、E-cad蛋白表達與NMIBC患者臨床病理特征的關系(例)

2.3 NMIBC預后的多因素分析 定義復發(0=否，1=是)為自變量，Tiam1(0=陰性，1=陽性)、E-cad(0=陰性，1=陽性)、性別(0=男性，1=女性)、病理分級(0=G1～G2，1=G3)、腫瘤數目(0=單發，1=多發)、腫瘤直徑(0=≤2 cm，1=>2 cm)為因變量進行COX回歸分析，結果顯示，腫瘤病理分級及Tiam1、E-cad陽性是復發的危險因素，見表2。

表2 NMIBC預后的多因素COX回歸分析

2.4 NMIBC組織中Tiam1與E-cad蛋白表達的關系 116例NMIBC患者中，Tiam1蛋白表達陽性46例，其中E-cad蛋白表達陽性26例；Tiam1蛋白表達陰性70例，其中E-cad蛋白表達陽性54例，Tiam1蛋白表達與E-cad蛋白表達呈負相關(χ2=-9.046，P=0.000)。

2.5 組織中Tiam1、E-cad表達與復發的關系 根據腫瘤標記物不同表達進行分組，分為Tiam1(+)E-cad(+)(A組，簡稱T+E+，以下同)、T+E-(B組)、T-E+(C組)、T-E-(D組)四組。其中A組20例，復發率50%(10/20)；B組26例，復發率65.38%(17/326)；C組54例，復發率25.93%(14/56)；D組26例，復發率37.5%(6/26)，差異有統計學意義(P<0.05)。B組患者術后復發率較其他三組升高，差異有統計學意義(P均<0.05)(見圖1)。

圖1 Tiam與E-cad不同表達組的復發率曲線

3 討論

膀胱癌是泌尿系統常見腫瘤，約占8%，大多數為NMIBC，臨床治療以手術為主，術后輔助膀胱灌注化療，但有30%～50%出現復發。如何預測復發是困擾臨床醫生的一大難題。

E-cad是細胞間黏附連接的重要黏附分子，是廣泛分布于胚胎組織及成年人組織上皮細胞中的黏附因子，在實體腫瘤發生、形成、浸潤、復發過程中起著至關重要作用，尤其是對維持細胞形態及細胞間黏附的調節起重要作用[3]。許多腫瘤的生物學特性與E-cad的不正常表達和(或)低表達密切相關，其表達陰性可促進膀胱癌復發、進展[4]。

Tiam1是等于1994年從鼠的T淋巴瘤中分離出來的一種腫瘤轉移誘導基因，其產物Tiam1蛋白作為鳥苷酸轉換因子，可特異性激活Rac-1，并通過Tiam-Rac1信號途徑改變腫瘤細胞的形態和功能，從而調節并誘導腫瘤的侵襲和轉移[5]。最近研究表明，Tiam1通過激活骨橋蛋白-CD44-Tiam1-Rac1通路抑制腫瘤抑制基因Rho GD12，從而促進腫瘤細胞的轉移、擴散[6]。大量研究顯示，Tiam1在多種腫瘤包括肺癌[7]、胃腺癌[8]、腎細胞癌[9，10]、浸潤性乳腺導管癌[11]中異常高表達，與腫瘤細胞的侵襲、轉移、惡性程度及預后關系密切。但Tiam1與膀胱癌的關系尚不明確。

Tiam1介導的Rac1激活可促進E-cad介導的細胞間黏附。E-cad及Tiam1表達異常與多種腫瘤發生有關，而且不同腫瘤組織中Tiam1表達不同[4]。在膀胱癌組織中可發現E-cad表達異常[4]，但Tiam1與E-cad在膀胱癌組織中是否存在異常表達尚未見報道。

本研究結果表明，NMIBC組織中E-cad及Tiam1均有不同程度表達，其異常表達與膀胱癌病理分級及復發有關；低級別NMIBC腫瘤組織中E-cad表達陽性率高于高級別腫瘤組織；相反，Tiam1在低級別腫瘤組織中表達陽性率低于高級別腫瘤組織；與此對應，與非復發病例比較，復發病例中，Tiam1表達高、E-cad表達低；提示Tiam1在NMIBC腫瘤組織中的作用與E-cad相反，E-cad作為重要的細胞間黏附因子，表達陰性可促進膀胱癌復發、進展。進一步分析表明，在NMIBC組織中Tiam1陽性及E-cad陰性的患者復發率更高，推測聯合檢測Tiam1及E-cad會更準確地預測膀胱癌是否復發。

目前關于E-cad在膀胱癌中的作用已有很多研究，均表明其作為抑癌基因存在，但Tiam1在膀胱癌中的作用機制尚不十分清楚，進一步研究Tiam1在膀胱癌發生、發展中的意義，將為降低膀胱癌復發或進展提供新的臨床思路;同時，敲除該基因是否會控制膀胱癌發生，將是我們今后研究的目標。