AXL激酶抑制劑對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

程健，張磊，秦克旺

(1南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院,廣州510317;2廣東省第二人民醫(yī)院)

鼻咽癌(是一種發(fā)生于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤，具有發(fā)病部位解剖結構復雜、病理分化程度低、易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點。大多數(shù)鼻咽癌患者在首次確診時已有局部淋巴結或遠處轉(zhuǎn)移[1]。鼻咽癌的主要治療手段是放射治療，但療效欠佳。因此，尋找一種療效顯著、創(chuàng)傷小、不良作用少的治療手段刻不容緩。受體酪氨酸激酶是位于細胞表面的跨膜受體，其介導的信號通路在正常和惡性細胞中均發(fā)揮著重要作用。1991年，O’bryan等[2]在慢性粒細胞白血病細胞中發(fā)現(xiàn)了第一個受體酪氨酸激酶亞家族-TAM(TYRO3-AXL-MER)家族。TAM家族包括TYRO3(又名Rse、Sky、Brt、Dtk、Etk2或Tif)、AXL(又名Ufo、Ark或Tyro7)和MER(又名NYK、EYK或TYRO12)[3～5]，其中AXL基因位于第19號染色體，由20個外顯子組成。近年研究顯示，AXL在多種惡性腫瘤中都存在高表達，如肺癌、乳腺癌、結腸癌、胃癌、肝癌和卵巢癌等。大量研究結果表明，AXL可以促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲。由于AXL在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要促進作用，因此以AXL為靶點的抗癌藥物逐漸成為研究熱點。TP0903是一種小分子AXL靶向藥物，由美國亨斯曼癌癥研究所的Mollard等[3]通過分子對接模擬設計合成。盡管AXL激酶抑制劑作為一種新型抗癌藥物得到了眾多研究者的積極探索，但其在鼻咽癌中的作用鮮有報道。2016年9月～2017年10月,本研究應用AXL激酶抑制劑TP0903作用于人類鼻咽癌細胞，觀察其對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，為鼻咽癌的分子靶向治療提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2均購自上海中科院細胞庫，TP0903購自Selleck公司，RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清購自美國Gbico公司，CCK-8試劑盒購自Sigma公司，6孔板、細胞培養(yǎng)瓶、Transwell小室均購自美國Coming公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。超凈臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱(美國SHEL-LAB，型號為 2406-2)，顯微圖像分析系統(tǒng)(丹吉爾集團公司，型號：DEIAS-2000C)，酶標儀(芬蘭Labsystem公司，型號:Multiskan MK3)。

1.2 細胞培養(yǎng) 鼻咽癌5-8F、SUNE2細胞均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于恒溫37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換1次液，當細胞密度達80%左右時傳代，取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

1.3 鼻咽癌細胞增殖能力的檢測 6孔板預試驗：取對數(shù)生長期鼻咽癌5-8F、SUNE2細胞，分別計數(shù)，然后按照每孔2.5×105細胞數(shù)量加入到6孔板中，按照預先設計好的實驗方案分為對照組和實驗組。24 h后向6孔板中加入不同濃度梯度的TP0903，對照組未加入TP0903(即所用的TP0903藥物濃度用0 μmol/L來表示，下同)，實驗組所用TP0903藥物濃度分別為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L進行處理；48 h后用甲醇固定，再用結晶紫染色。待染色結束后，通過觀察染色深淺的程度來判斷細胞密度，從而得到TP0903對鼻咽癌細胞的有效抑制濃度。CCK-8試驗：分別消化鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2，計數(shù)后,按每孔5 000個細胞接種于96孔板，待細胞貼壁后加入TP0903，分為對照組(0 μmol/L TP0903)和實驗組。根據(jù)6孔板的實驗結果，鼻咽癌細胞SUNE2對TP0903比細胞5-8F更為敏感。所以在實驗組中，選用0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/LTP0903作用于鼻咽癌細胞5-8F；同時選用0.125、0.25、0.5 μmol/L TP0903作用于鼻咽癌細胞SUNE2。每組設置5個復孔。TP0903分別培養(yǎng)24、48、72 h后，向培養(yǎng)板中每孔加入CCK-8液10 μL，避光孵育2 h后使用多功能酶標儀檢測450 nm波長的吸光度(A)值，計算細胞存活率，計算公式為：存活率(空白)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]。A(加藥):具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A(空白)：只有溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A(0加藥)：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物的孔的吸光度。重復操作此實驗3次。

1.4 鼻咽癌細胞遷移能力檢測 劃痕試驗：取生長良好的5-8F、SUNE2細胞，分別以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，直至細胞長至飽和狀態(tài)后，吸去上層培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌2次，用無菌Tip頭在細胞板上劃痕，再用PBS緩沖液洗滌3次。向每孔加入含1.5%胎牛血清培養(yǎng)基，并向每孔中加入TP0903。分為對照組(0 μmol/L)和實驗組(藥物濃度為0.25、0.5 μmol/L)，分別于0、24 h在倒置顯微鏡下獲取圖像后用Image J 2x軟件統(tǒng)計各組劃痕寬度。結果以劃痕寬度百分比(%)表示，劃痕寬度百分比(%)=(24 h的劃痕寬度/0 h劃痕寬度)×100%。重復操作此實驗3次。Transwell小室趨化試驗：取生長良好的鼻咽癌細胞，消化、計數(shù)后，分別以5×104個細胞接種于Transwell小室的上室，并向上室中加入TP0903，分為對照組(0 μmol/L TP0903)和實驗組(藥物濃度為0.25、0.5 μmol/L)。然后加入無血清的1640培養(yǎng)基200 μL。在下室中加入與上室含有相同濃度梯度的TP0903，然后加入含10%胎牛血清1640完全培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)箱孵育24 h后，取出小室，用棉簽擦去上室濾膜上未穿過的細胞，以中性甲醛固定，結晶紫染色，洗滌，待其干燥后，將小室倒置在100倍光鏡下隨機選擇中央及四周8個視野計數(shù)細胞數(shù)，統(tǒng)計后取其均值，重復操作此實驗3次。

1.5 鼻咽癌細胞侵襲能力的檢測 采用Transwell小室侵襲試驗。實驗前在Transwell濾膜上室面包被人工基底膜膠，取生長良好的鼻咽癌細胞，消化、計數(shù)后，分別以5×104個細胞接種于Transwell小室的上室，對照組不加入TP0903，實驗組向上室中加入TP0903(藥物濃度為0.25、0.5 μmol/L)。然后加入無血清的1640培養(yǎng)基200 μL。實驗組在下室中加入與上室相同濃度梯度的TP0903，然后加入含10%胎牛血清1640完全培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)箱孵育24 h后，取出小室，用棉簽擦去上室濾膜上未穿過的細胞，中性甲醛固定，結晶紫染色，洗滌，干燥后，小室倒置在100倍的光鏡下隨機選擇中央及四周8個視野計數(shù)細胞數(shù)，取其均值，實驗重復3次。

2 結果

2.1 兩組鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2增殖能力比較 6孔板預試驗結果顯示，隨著濃度梯度的不斷增大，細胞密度逐漸降低;且相同濃度的TP0903對鼻咽癌細胞SUNE2的抑制作用更強。CCK-8試驗結果證實了TP0903對鼻咽癌細胞的增殖能力有抑制作用，且藥物作用濃度越大，細胞存活率越低。鼻咽癌細胞5-8F:實驗組中0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L TP0903作用后細胞存活率分別為95.72%±3.12%、81.02%±9.38%、64.99%±12.17%、55.92%±12.91%。對照組為1。與對照組比較，1.0、2.0、4.0 μmol/L TP0903作用后，細胞存活率均降低，且兩兩比較，P均<0.05。鼻咽癌細胞SUNE2：實驗組中0.125、0.25、0.5 μmol/L TP0903作用后，細胞存活率分別為88.46%±11.90%、85.68%±7.20%、28.00%±16.91%，對照組為1。與對照組比較，4.0 μmol/L TP0903作用后，細胞存活率降低(P<0.05)。

2.2 兩組鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2的遷移能力比較 劃痕試驗結果顯示，實驗組鼻咽癌細胞的遷移距離較對照組縮短(P均﹤0.05)。見表1。Transwell小室趨化試驗結果顯示，與對照組比較，實驗組穿過Transwell小室的細胞數(shù)均減少，以0.5 μmol/L TP0903處理為著(P均﹤0.05)。見表2。

表1 兩組鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2遷移能力比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

表2 鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2的遷移數(shù)量比較(個，

注：與對照組比較，*P<0.01；與0.25 μmol/L比較，#P<0.05。

2.3 兩組鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2侵襲能力比較 Transwell小室侵襲試驗結果顯示，TP0903處理鼻咽癌細胞后，實驗組和對照組相比，實驗組穿過Transwell小室的細胞數(shù)量減少，以0.5 μmol/L TP0903處理為著(P均﹤0.05)。見表3。

3 討論

近年腫瘤的分子靶向治療取得了空前進步。AXL作為多種惡性腫瘤的新靶點引起學術界廣泛關注。大量研究報道，AXL在多種惡性腫瘤組織及細胞中存在高表達，其表達量與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力密切相關。Gay等[4]在人類乳腺癌中的研究結果顯示，AXL能夠通過增強內(nèi)皮細胞的增殖和遷移能力來促進乳腺癌腫瘤性血管的生成，進而引起腫瘤細胞不斷生長和惡性轉(zhuǎn)化。Koorstra等[5]研究發(fā)現(xiàn)，AXL的表達影響了胰腺癌患者的預后，AXL陽性表達者生存率低于陰性表達者。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細胞在某些特定條件下，獲得了游走遷移能力和浸潤性，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)樣表型細胞的生物學過程，是腫瘤細胞發(fā)生增殖、遷徙、轉(zhuǎn)移等過程中的重要生物學行為。近期研究報道，AXL過表達與腫瘤細胞的間質(zhì)樣表型密切相關，其可通過誘導多種腫瘤細胞的EMT途徑來增強腫瘤細胞的侵襲能力，增加轉(zhuǎn)移概率，并產(chǎn)生耐藥性，嚴重影響患者預后。Wu等[6]在非小細胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達的AXL可以調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白的表達量，誘導EMT過程的發(fā)生，從而促進腫瘤細胞的遷移。Lee等[7]在口腔鱗癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，AXL可通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路介導EMT過程的發(fā)生。此外，Lee等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AXL可通過細胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路誘導肝癌細胞EMT過程的發(fā)生，進而增強細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力；抑制AXL的表達，肝癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力也隨之減弱。提示AXL與EMT過程的發(fā)生有密切關聯(lián)。

表3 兩組鼻咽癌細胞5-8F、SUNE2的侵襲能力比較( 個，

注：與對照組比較，*P<0.01；與0.25 μmol/L比較，#P<0.05。

本研究通過6孔板試驗和CCK-8試驗證實，AXL抑制劑TP0903能夠抑制鼻咽癌細胞增殖；與此同時，細胞劃痕試驗和Transwell小室遷移試驗結果表明TP0903抑制劑能夠降低腫瘤細胞的遷移能力。進一步，5-8F與SUNE2細胞系在加入TP0903共孵育24 h后，Transwell小室侵襲能力明顯降低，提示腫瘤細胞入侵能力下降。以上實驗結果表明，AXL抑制劑TP0903對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲能力有明顯的抑制作用，且抑制效果與濃度呈正比。結合既往報道中AXL與EMT過程密切關聯(lián)，推測其作用機制可能與AXL激酶抑制劑抑制了鼻咽癌細胞的EMT路徑有關。

本研究結果表明，TP0903能夠抑制鼻咽癌-8F和SUNE2細胞系的增殖、遷移及侵襲能力，為鼻咽癌的分子靶向治療提供了基礎理論支持；但AXL激酶抑制劑究竟是如何影響鼻咽癌細胞的增殖、遷移、侵襲的能力，其具體信號通路及作用機制還有待進一步探討。