糖尿病視網膜病變患者血漿中miR-21、miR-93的水平變化及臨床意義

李雷，唐平

(海南醫學院第一附屬醫院,?？?70102)

糖尿病視網膜病變屬于糖尿病患者最常見的并發癥之一，其主要發病機制為糖尿病損害視網膜上的毛細血管，從而使得周圍組織水腫、出血，甚至毛細血管阻塞，進一步導致視網膜缺血、缺氧，促進新的增殖物產生，導致視網膜病變[1]。有研究報道證實，隨著糖尿病患者病程增加，視網膜病變的發生風險越高[2]。因此，對糖尿病視網膜病變患者進行早期有效的診斷和治療顯得尤為重要。隨著近年相關研究的深入，越來越多的學者發現微小核糖核酸(miRNA)參與了細胞的增殖、分化以及凋亡等過程，且miR-21與miR-93在眼部疾病中的表達明顯異常，可能成為眼部疾病診斷、治療的新靶點[3]。鑒于此，本文探討了糖尿病視網膜病變患者血漿中miR-21、miR-93的水平變化并分析了其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年2月～2018年2月海南醫學院第一附屬醫院收治的糖尿病視網膜病變患者109例(視網膜病變組)。其中男61例、女48例，年齡32～78(57.32±10.52)歲。另取本院收治的單純糖尿病患者100例(單純糖尿病組)，其中男57例、女43例，年齡31～80(57.40±10.47)歲。再取同期于本院進行體檢的健康人員100例作為對照組，其中男54例、女46例，年齡30～77(57.27±10.38)歲。三組性別、年齡比較，P均>0.05。納入標準[4]：糖尿病患者均符合1999年世界衛生組織糖尿病專家委員會提出的相關診斷標準；糖尿病視網膜病變患者均符合臨床眼科影像學診斷標準；年齡>20歲；臨床病歷資料完整；入院前均未接受相關治療。排除標準：合并心、肝、腎等臟器功能嚴重障礙者；伴有急慢性感染性疾病、惡性腫瘤以及心腦血管疾病者；存在精神疾病或交流溝通障礙者。三組患者及其家屬均簽署知情同意書，本院倫理委員會已批準。

1.2 觀察指標及其檢測方法 三組入院后均采集清晨空腹靜脈血10 mL，以3 000 r/min離心10 min，分別取血清與血漿保存于-80 ℃冰箱中待檢。常規生化指標的檢測：血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平：采用日立7060全自動生化分析儀測定；空腹血糖(FPG)水平：采用葡萄糖氧化酶法檢測；血漿糖化血紅蛋白(HbA1c)：采用高效液相色譜法測定；血漿內酯素、抵抗素以及瘦素水平：采用脂肪因子免疫酶聯吸附法測定，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，相關試劑盒均購自日本SHINO-TEST公司。血漿miR-21、miR-93水平的檢測：采用德國Qiagen公司的miRNeasy血漿提取試劑盒提取血漿總miRNA。采用ABI 7500型熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR反應，內參為U6，miRNA逆轉錄反應體系包括RNA模板5 μL，U6 3 μL，miRNA特異性莖環引物3 μL，100 mmol/L的脫氧核糖核苷酸0.15 μL，逆轉錄酶1 μL，RNase抑制劑0.19 μL，無菌三蒸水4.16 μL。反應條件如下：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，保存于4 ℃中進行逆轉錄反應。以U6為內參，擴增條件如下：95 ℃ 10 min ，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s共40個循環。實驗重復3次，根據公式2-ΔΔCt計算miRNA相對表達水平。

2 結果

2.1 三組各項臨床生化指標水平對比 視網膜病變組FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素水平均高于單純糖尿病組與對照組，而內酯素水平均低于單純糖尿病組與對照組；且單純糖尿病組FPG、HbA1c水平均高于對照組(P均<0.05)，見表1。

表1 三組各項臨床生化指標水平對比

注：與對照組相比，#P<0.05；與單純糖尿病組相比，*P<0.05。

2.2 三組血漿miR-21、miR-93表達水平比較 視網膜病變組血漿miR-21與miR-93表達水平均高于單純糖尿病組與對照組(P均<0.05)，見表2。

表2 三組血漿miR-21與miR-93表達水平比較

注：與對照組相比，#P<0.05；與單純糖尿病組相比，*P<0.05。

2.3 糖尿病視網膜病變患者血漿miR-21、miR-93與各生化指標的相關性分析 Preason相關性分析結果顯示，糖尿病視網膜病變患者血漿miR-21、miR-93分別與FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素呈正相關(r分別為0.503、0.625、0.679、0.636，0.485、0.613、0.684、0.627；P均<0.05)，而與內酯素均呈負相關(r分別為-0.608、-0.583，P均<0.05)。

2.4 糖尿病視網膜病變發生的多因素分析 多因素Logistic回歸分析結果顯示，血漿FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素及miR-21、miR-93均是糖尿病視網膜病變的獨立危險因素，而內酯素為保護性因素(P均<0.05)。見表3。

表3 糖尿病視網膜病變發生的多因素Logistic回歸分析

3 討論

糖尿病視網膜病變屬于糖尿病嚴重并發癥之一，該病會對患者的視功能造成一定程度的損害，從而導致視物模糊不清、甚至突然視物不見等多種臨床癥狀，對患者的生活質量造成了嚴重影響[5，6]。因此，早期有效的監測以及治療顯得尤為重要。miRNA屬于內源性非編碼單鏈RNA分子，在視網膜組織中的表達具有特異性[7，8]。有研究報道顯示，miRNA可能是通過誘導細胞分化、調節炎癥反應等機制參與糖尿病視網膜病變的發生、發展過程[9，10]。

本研究結果發現，視網膜病變組FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素水平均高于單純糖尿病組與對照組，而內酯素水平均低于單純糖尿病組與對照組；且單純糖尿病組FPG、HbA1c水平均高于對照組，提示視網膜病變患者FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素水平存在明顯高表達，而內酯素水平存在明顯低表達。內酯素在機體內屬于血清調節因子，在糖脂代謝與炎癥反應以及免疫應答過程中起著重要作用，其水平的不足會導致機體血糖調節異常，對眼部微血管具有較大的損害作用，并可進一步加重患者的病情以及視網膜病變程度[11]。抵抗素屬于炎癥細胞因子之一，具有促進炎癥介質釋放以及調節血管功能的作用，其含量增多會增加血管通透性，從而增加了水腫、蛋白尿以及臟器損傷的發生風險，最終加重糖尿病所致眼部微血管病變損傷[12]。瘦素則可對血管生成以及血小板凝聚造成影響，同時具有較強的血管收縮效應，可導致視網膜血管壓力升高，進一步引發視網膜毛細血管內皮受損，最終導致視網膜病變發生[13]。此外，本研究結果顯示，視網膜病變組血漿miR-21與miR-93表達水平均高于單純糖尿病組與對照組，提示視網膜病變組患者機體的miR-21以及miR-93表達水平更高。符春艷等[14]研究顯示，miR-21以及miR-93的表達可能在糖尿病視網膜病變的發生發展過程中起著至關重要的作用。有研究報道顯示，多種miRNA表達水平在急性光誘導視網膜損傷小鼠中升高，其可能是通過增加糖尿病中細胞外基質纖維連接蛋白，進一步促進糖尿病視網膜病變的發生[15，16]。因此，miR-21與miR-93可能參與了糖尿病視網膜病變的進展。另外，多因素Logistic回歸分析結果顯示，FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素與血漿miR-21、miR-93均是糖尿病視網膜病的獨立危險因素，而內酯素為保護性因素。提示上述因素均參與了糖尿病視網膜病變的發生，臨床上可通過針對上述因素制定相關干預措施，從而有效降低糖尿病視網膜病變發生的風險。同時，經Pearson相關性分析可得，糖尿病視網膜病變患者血漿miR-21、miR-93與FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素均呈正相關，而與內酯素均呈負相關。這也再次證實了糖尿病視網膜病變患者病情越重，血漿miR-21、miR-93表達水平越高，兩者可能成為臨床上判斷糖尿病視網膜病變患者病情嚴重程度的有效指標。

綜上所述，糖尿病視網膜病變患者血漿miR-21、miR-93均存在明顯高表達，此二者可能參與了病情進展。臨床工作中可通過對兩項指標進行檢測，從而早期診斷糖尿病視網膜病變。