子宮內膜樣腺癌組織中錯配修復基因的表達變化及其相關影響因素

劉彩虹,于淑莉,武文杰

(1承德護理職業學院，河北承德 067000；2承德市婦幼保健院)

子宮內膜癌是女性最常見惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，以子宮內膜樣腺癌最常見，占80%～85%，常伴有子宮內膜增生,其中子宮內膜不典型增生被認為是癌前期病變[1]。子宮內膜癌近年來呈年輕化趨勢，發病率逐年上升，其中散發病例約占90%，有遺傳背景的病例約占10%[2]。錯配修復是細胞復制后的一種修復機制，起著維持DNA復制保真度和控制基因突變的作用，錯配修復基因(MMR)缺陷引起的常染色體顯性遺傳病被稱為Lynch綜合征(LS)，其中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2是最常見發生突變的四個MMR基因。LS特征為早發性結腸癌，常同時或異時伴有其他腸外器官腫瘤，其中子宮內膜癌是其最常見的腸外腫瘤[3]。目前MMR表達和突變檢測的研究主要集中于結腸癌，并且在國際上已被規范地應用于結直腸癌患者篩查[4]。但在子宮內膜癌和子宮內膜非典型增生中有關MMR的研究較少，結果尚無定論。本研究中我們應用免疫組化法檢測正常周期子宮內膜、非典型增生子宮內膜以及子宮內膜樣腺癌標本中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白的表達情況，以探討MMR缺陷與子宮內膜癌發生發展的關系及其影響因素。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取承德市婦幼保健院病理科2013年1月～2017年12月存檔的石蠟包埋標本，由兩位高年資病理科醫師復閱切片明確診斷。嚴格按照WHO診斷標準，納入研究子宮正常組織和子宮內膜樣腺癌標本共200例份。其中正常周期子宮內膜標本50例份(正常組)、非典型增生子宮內膜標本50例份(增生組)、子宮內膜樣腺癌標本100例份(腺癌組)。腺癌組中，年齡(53.2±6.8)歲，≤50歲25例，>50歲75例；體質量指數(BMI)≤24 kg/m2者38例，>24 kg/m2者 62例；月經初潮年齡≤13歲77例，>13歲23例；國際婦產科醫師聯盟(FIGO)分期：Ⅰ～Ⅱ期55例，Ⅲ～Ⅳ期45例；合并其他部位惡性腫瘤史7例，未合并93例；肌層浸潤深度：≤1/2肌層65例，>1/2肌層35例；腫瘤組織分化程度：高分化37例，中低分化63例；有淋巴結轉移26例，無淋巴結轉移74例。增生組中，年齡(53.9±7.2)歲，≤50歲11例，>50歲39例；正常組中，年齡(52.7±6.2)歲，≤50歲10例，>50歲40例。各組年齡比較差異無統計學意義(P均>0.05)。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 MMR的檢測 采用免疫組化En Vision法。嚴格按照試劑說明書操作，鼠單克隆抗體MLH1、MSH2、MSH6和PMS2、免疫組化En Vision試劑盒以及二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司。具體步驟如下：石蠟標本行4 μm厚連續切片，切片脫蠟、水化，在0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)中進行煮沸熱修復法修復抗原，以3% H2O2甲醇液阻斷內源性過氧化物酶10 min，洗滌后滴加一抗鼠單克隆抗體MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，以PBS代替一抗作為陰性對照，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗后滴加二抗，37 ℃孵育40 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。結果判定：MMR蛋白陽性表達的判斷標準為細胞核出現棕黃色顆粒[5]。兩位高年資病理科醫師閱片，選取10個高倍鏡視野計算陽性細胞所占比例，陽性細胞數≤10%為陰性，>10%為陽性。以一種及以上MMR蛋白陰性表達判定為微衛星不穩定性(MSI)[6]。以發生MSI的子宮內膜樣腺癌判定為LS相關子宮內膜癌。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MLHl、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達 MLHl、MSH2、MSH6、PMS2蛋白陽性表達主要位于細胞核，為黃色或棕黃色顆粒。見圖1。

圖1 子宮內膜腺樣腺癌患者MSI(×200)

注：MLH1蛋白陰性表達(圖A)；MSH2蛋白陽性表達(圖B)；PMS2蛋白陽性表達(圖C)；MSH6蛋白陽性表達(圖D)。

2.2 各組MLH1、MSH2、PMS2、MSH6陰性表達率及MSI發生率比較 三組MLH1和PMS2陰性表達率比較，腺癌組>增生組>正常組，P均<0.05。各組MSH2和MSH6陰性表達率比較，P均>0.05。各組MSI發生率比較，腺癌組>增生組>正常組，P均<0.05。見表1。

表1 各組MLH1、MSH2、PMS2、MSH6陰性表達率及MSI發生率比較[例(%)]

2.3 LS相關子宮內膜癌與散發癌患者臨床病理特征比較 100例子宮內膜樣腺癌組織中，存在MSI 38例(LS相關子宮內膜癌)，不存在MSI 62例(散發癌)。LS相關子宮內膜癌與散發癌患者相比，年齡、合并其他部位惡性腫瘤史等差異有統計學意義(P均<0.05)，浸潤深度、月經初潮年齡、BMI、FIGO分期、分化程度、淋巴結轉移等差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 LS相關子宮內膜癌與散發癌患者臨床病理參數的比較(例)

3 討論

MMR基因系統是近年在遺傳性非息肉病性結直腸癌中分離出的控制人體基因變異、維持基因穩定的基因系統。MMR基因系統蛋白能夠特異性地識別并糾正DNA堿基的錯誤配對以及消除插入-缺失環的形成，在維持遺傳穩定性和完整性方面發揮著重要作用，是人體細胞的一種安全保障體系。機體MMR功能異?？梢栽斐杉毎鸇NA修復錯誤，導致患者DNA出現MSI，促進腫瘤的發生。MSI已被公認為繼癌基因和抑癌基因之后腫瘤研究方面的又一個重大進展[7]。目前MMR基因系統缺陷在結直腸癌基因研究、患病風險預測、分子機制及腫瘤預防方面均取得了很大進展[8]。子宮內膜是人體增生最活躍的組織之一，細胞中DNA復制頻繁、堿基錯配率較高、MMR基因系統缺失發生MSI，可能促進子宮內膜癌的發生發展。近年有關MMR基因系統在子宮內膜癌和子宮內膜不典型增生發生發展中作用的研究逐漸引起各國學者的注意，但結果不一致，尚未形成共識[9]。DNA測序是檢測MSI最可靠的方法，但由于檢測費用很高，在無目標人群時，臨床難以廣泛應用。免疫組化檢測錯配修復蛋白表達缺失與DNA測序檢測結果之間有很高的吻合度，費用較低，易于臨床廣泛開展，并且靈敏性和特異性很高[6,10]。本研究中，我們通過免疫組化法檢測正常周期子宮內膜、非典型增生子宮內膜以及子宮內膜樣腺癌標本中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白的表達情況，發現腺癌組MSI發生率高于其他各組，并且增生組MSI發生率高于正常組，提示MMR基因表達缺失造成的MSI在子宮內膜樣腺癌的發生發展中發揮著重要作用。

迄今為止，已分離出9種MMR基因,其中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2是最常見發生突變的四個MMR基因。在DNA復制過程中，首先MSH2和MSH6相互結合形成MutS-α二聚體復合物結合到錯配修復區域，再與MutL-α二聚體復合物(MLH1和PMS2互相結合形成)結合，啟動DNA修復反應，切除錯配修復區域的DNA片段，并重新合成DNA連接。其中任何一個MMR基因的缺失表達都將導致MMR系統功能異常，促進腫瘤的發生。近年國內外相關文獻報道，子宮內膜樣腺癌中四個MMR基因蛋白的表達缺失率不甚相同。各個研究報道缺失率不同的原因可能與種族、地區、年齡以及樣本數量差異有關[11]。本研究中我們發現子宮內膜樣腺癌中MLH1、MSH2、PMS2和MSH6陰性表達率分別為29%、10%、21%、7%，以MLH1和PMS2的陰性表達為主，與國內外研究[12～15]基本一致。進一步統計學分析，我們發現腺癌組、增生組與正常組MLH1和PMS2陰性表達率比較差異有統計學意義，但各組MSH2和MSH6陰性表達率比較差異無統計學意義，提示MLH1和PMS2的陰性表達在子宮內膜樣腺癌的發生發展中可能發揮著更重要的作用。

Walsh等[16]在研究中通過免疫組化法檢測4種MMR蛋白，發現至少有1種蛋白缺失在年齡<50歲的子宮內膜癌患者中比例較高。Wang等[17]報道，LS相關子宮內膜癌的顯著特點是發病年齡早，對比發現LS相關子宮內膜癌患者年齡低于散發癌患者。為了進一步明確LS相關子宮內膜癌的臨床發病特點及MSI發生的相關影響因素，我們進一步統計分析發現LS相關子宮內膜癌患者與散發癌患者相比，在年齡、合并其他部位惡性腫瘤史等方面差異存在統計學意義，LS相關子宮內膜癌在低齡及合并其他部位惡性腫瘤史的患者中更常見，而兩組患者在月經初潮年齡、BMI、FIGO分期、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移等方面差異無統計學意義，提示MSI發生與低齡及合并其他部位惡性腫瘤有關。在臨床工作中，對于低齡、合并有其他部位惡性腫瘤的子宮內膜樣腺癌患者應注意篩選LS相關子宮內膜癌，對可疑LS相關子宮內膜癌應該加強隨訪，預防異位癌的發生，早診斷、早發現、早治療。

綜上所述，子宮內膜樣腺癌發生過程中，MLH1、PMS2蛋白缺失，可導致MSI；MSI的發生與低齡及合并其他部位惡性腫瘤史有關。