泡球蚴感染小鼠肝M2型巨噬細胞的變化

李斌，王亮，劉玉梅，楊寧，閆怡,，姜濤，高劍，丁劍冰，馬秀敏,阿曼古麗·牙生

(1新疆醫科大學第一附屬醫院·省部共建中亞高發病成因與防治國家重點實驗室，烏魯木齊830011；2新疆醫科大學基礎醫學院)

泡型包蟲病是由多房棘球絳蟲的幼蟲泡球蚴作為主要病原體的一種致死率高、危害嚴重的人畜共患寄生蟲病。泡型包蟲病多始發于肝臟，泡球蚴在肝臟寄生后，從母泡囊會不斷增殖出新的子泡囊，因其出芽式的生長方式與惡性腫瘤相似，故又有“蟲癌”一稱。巨噬細胞作為多種免疫細胞中重要的一員，有多種功能，可以在特異性免疫和非特異性免疫中同時發揮不同作用。有學者將巨噬細胞大致分為M1和M2兩種極化類型，M1型巨噬細胞主要參與Th1型免疫反應，是通常理解的發揮正向作用的功能細胞；M2型巨噬細胞則主要參與Th2型免疫反應和體液免疫，其可以使細胞內的病原體受到相對較弱的殺傷力，同時加強清除機體殘留物質的能力[1]。研究表明，在某些疾病的發展進程中，病原體會為了躲避巨噬細胞的噬菌作用從而迫使其從M1型向M2型發展，從而進一步加快疾病的發展進程[2]。2017年7月～2018年5月，本研究通過檢測泡球蚴感染小鼠肝臟中M2型巨噬細胞的動態改變，探討其在泡球蚴感染小鼠肝臟中的可能免疫機制，為泡球蚴感染的基礎和臨床研究提供初步實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物: 雌性BALB/c小鼠48只，保種BALB/c小鼠1只,6～8周齡，體質量18～22 g，購自新疆醫科大學實驗動物中心。主要試劑和儀器:CD163多克隆兔抗鼠抗體購自北京博奧森公司。磷酸鹽緩沖液粉末、枸櫞酸鹽緩沖液粉末、生物素標記的通用型二抗試劑盒購自北京中衫生物技術有限公司。PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 動物模型建立及分組 將感染泡球蚴的保種BALB/c小鼠處死，取出感染組織，分離出壞死組織，用5 mL注射器將嚢液吸出，剩余組織剪碎、研磨、200目尼龍網過篩，使用含青鏈雙抗的生理鹽水反復沖洗沉淀3次，最后1次沉淀后用PBS重懸，用0.5%伊紅染料計數原頭節的著色率及形態，確保原頭節的存活率>90%后，準備腹腔注射。將48只BALB/c小鼠隨機分為對照組，模型組各24只。模型組小鼠每只腹腔注射2 000個原頭節，對照組小鼠每只注射等體積的生理鹽水。

1.3 標本采集 分別于接種后90、180、300 d頸椎脫臼法處死8只對照組小鼠和對應模型組的全部小鼠，打開腹腔，暴露肝臟，無菌剝取小鼠的肝臟，一部分置于10%的中性甲醛溶液中，固定24 h以上，后用于HE染色和免疫組織化學檢測。另一部分經液氮快速冷凍后轉移至-80 ℃冰箱，后用于提取總RNA，待實時熒光定量PCR檢測。

1.4 組織標本HE染色 將固定好的組織進行組織脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后進行常規HE染色、封片，顯微鏡下觀察病理學變化。

1.5 肝臟組織CD163蛋白表達水平的檢測 采用免疫組化法。制片方法同HE染色，將制得的片子常規脫蠟至水后，使用3%過氧化氫室溫孵育10 min，枸櫞酸鹽緩沖液95 ℃微波修復15 min，冷卻至室溫，滴加山羊血清工作液37 ℃封閉30 min，滴加一抗，4 ℃孵育過夜，室溫放置1 h后滴加生物素標記的通用型二抗室溫孵育2 h，DAB室溫顯色，蘇木素復染后快速脫水封片。其中陰性對照的一抗使用PBS代替。鏡下觀察，每張肝組織免疫組化切片在400倍光鏡下隨機選取5個不同視野分別采集圖像，將陽性表達和陰性表達所占的面積使用Image J軟件進行統計，再算出陽性面積百分比和標準差。

1.6 肝臟組織Fizzl mRNA表達水平的檢測 采用實時熒光定量PCR法。從-80 ℃冰箱分別取對照組、模型組接種90、180、300 d約100 mg肝組織，采用TRIzol法抽提總RNA，測定OD260/280值并記錄濃度，OD260/280值在1.8～2.1。將所有標本總RNA濃度調整到500 ng/μL，各取總RNA 1 μL使用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒逆轉錄cDNA，將制成的cDNA標本分別取2 μL加入PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒中的qPCR體系，于實時熒光定量PCR儀上檢測Fizz1、GAPDH的表達量。實時熒光定量PCR中所用的引物由上海生工公司合成，其上游引物序列：5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，下游引物序列：5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′；Fizz1基因作為目的基因，其上游引物序列：5′-TCCAGCTAACTATCCCTCCACTGT-3′，下游引物序列：5′-GGCCCATCTGTTCATAGTCTTGA-3′。選擇小鼠GAPDH基因作為內參。記錄反應后各組Ct值，采用2-ΔΔCt相對定量法對各目標基因進行定量。

2 結果

2.1 各組大體觀察結果 肉眼所見：對照組小鼠解剖后未見肝臟和腹腔存在異常變化，肝臟質地柔軟、光滑，色澤紅潤，無明顯粘連，肝臟解剖位置正常。模型組接種90 d解剖后發現，小鼠腹腔內彌散許多囊泡，大小不等，多為小囊泡融合而成。與對照組相比，肝臟質地稍硬，體積稍增大，色澤較暗淡，與周圍組織和胸腔存在部分粘連，解剖位置已偏離正常位置。接種180 d解剖后發現，小鼠腹腔中存在大量囊泡，部分體積較大，囊泡中存在壞死、鈣化，與被侵蝕的組織分界較模糊。被囊泡侵蝕的肝臟顏色暗淡，部分已經變黃、變白，質地偏硬，體積較對照組有所縮小，與胸腔和周圍臟器粘連明顯且不易分離，已明顯偏離正常解剖位置。接種300 d解剖后發現，腹腔內粘連嚴重，囊泡體積巨大，被囊泡侵蝕的肝臟已不能完整分離，其部分顏色暗淡，質地較硬，已完全脫離正常解剖位置。鏡下觀察：對照組小鼠肝組織結構正常，肝小葉結構完整，肝細胞邊界清晰，排列整齊，可見肝細胞質疏松化，偶見炎性細胞聚集。模型組接種90 d肝小葉結構較完整，可見炎性細胞浸潤加重，部分膽管增生，可見囊泡的囊壁形成，囊壁內側偶見頭節。接種180 d，正常肝小葉結構紊亂，部分肝細胞壞死明顯，出現空泡樣變性，大量炎性細胞浸潤，纖維結締組織增生明顯。接種300 d，部分肝小葉結構已不可見，空泡樣變性明顯，大量炎性細胞浸潤，纖維結締組織繼續增生。

2.2 不同時期小鼠肝臟組織CD163表達比較 在感染后不同時間段，對照組小鼠肝臟中很少或者基本不表達CD163。相比于對照組， 90 d時模型組肝臟組織中CD163的表達升高(P<0.05)；180 d時CD163的表達水平達到峰值(P<0.01)；300 d時CD163的表達呈現出下降趨勢，但仍比對照組高(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 不同時期小鼠肝臟組織CD163的免疫組化結果(×400)

注：A：對照組；B、C、D：模型組接種90 d、180 d、300 d。

表1 兩組不同時期小鼠肝臟組織CD163蛋白表達比較

2.3 兩組不同時期肝臟組織Fizz1 mRNA表達比較 對照組肝臟組織中Fizz1 mRNA相對表達量在90、180、300 d基本穩定。與同期對照組相比，90 d，模型組肝臟中Fizz1 mRNA的相對表達量增加(P=0.004)；180 d，模型組Fizz1 mRNA的相對表達量達到峰值(P=0.000)；而300 d，模型組Fizz1 mRNA的相對表達量有所下降，但差異有統計學意義(P=0.001)(見圖2、表2)。

圖2 兩組不同時期肝臟組織Fizz1 mRNA的表達比較

表2 各組小鼠肝臟中Fizz1 mRNA的相對表達量比較

3 討論

寄生蟲病在人類傳染病中占有十分重要的地位，泡型包蟲病是一種流行在畜牧地區的人畜共患寄生蟲病，具有潛伏期長、病死率高等特點。人因誤食多房棘球絳蟲的蟲卵成為中間宿主而患病，并且患者的原發病灶多為肝臟。巨噬細胞是固有免疫和適應性免疫的重要組成部分，在感染性疾病中發揮了重要作用。本實驗以泡球蚴感染的小鼠為模型，檢測了感染中、后期小鼠肝臟組織中M2型巨噬細胞的動態變化，試說明其與泡球蚴感染中晚期的關系。

肝臟中巨噬細胞占非實質細胞的35%[3]，在調節生理機能、維持各項功能的動態平衡、炎癥反應中是不可或缺的一部分。特異性和可塑性是巨噬細胞的特點，在不同微環境和細胞因子的綜合影響下，巨噬細胞可以極化成不同類型，即經典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型具有釋放促炎因子、調節Th1型免疫、抗原的提呈等功能；而M2型則表現出“抑炎”功能，可以促進血管生成和組織修復。IL-4、IL-10、IL-13等均可刺激巨噬細胞實現M2型極化，STAT6信號通路在被IL-4/IL-13激活后可以增加M2型極化所必需的相關基因表達，如Mrc1、Ym1、Fizz1。CD163作為M2型巨噬細胞的特異性標記之一，起調節人體免疫的作用。它可識別腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導因子，并與其特異性結合，發揮抗炎作用，對部分病原體進行實時監測；在炎性反應刺激下，CD163與其配體相結合后，通過信號轉導，促使單核細胞與上皮細胞黏附，誘導IL-10等炎性因子釋放。但不能簡單地將CD163的功能概括成抗炎作用，它在免疫調節中的作用十分復雜，具體機制還有待更深入研究[4～6]。研究表明，在血吸蟲感染過程中，肝臟的早期免疫反應類型以Th1型為主，隨著感染的進行，逐漸向Th2型轉變，巨噬細胞的極化類型也從M1型轉化成M2型[7]。

Wynn等[8]研究表明，通過誘導產生M2型巨噬細胞極化，抑制M1型巨噬細胞促炎因子的釋放，可抑制肝臟纖維化進程。Abdallahi等[9]認為，M2型巨噬細胞極化抑制Th1細胞分泌的促炎因子釋放，會有利于蠕蟲的生長。Blériot等[10]研究表明，IL-4能誘導單核來源的巨噬細胞從M1型轉化為M2型，同時可作用于尚存的巨噬細胞，使其局部增殖并分化為M2型巨噬細胞，后者通過分泌IL-10，活化精氨酸酶，進而刺激單核細胞來源的M1型巨噬細胞的凋亡[11～14]。M2型巨噬細胞能通過分泌大量抗炎因子，如TGF-β、IL-10等，削弱炎癥反應，介導免疫耐受，如在小鼠細粒棘球蚴感染后期，體內IL-10持續高表達[15]。

本實驗通過免疫組化以及qRT-PCR法檢測了泡球蚴感染中后期小鼠肝臟內M2型巨噬細胞的特異性標志和基因表達變化。結果顯示，與對照組相比，模型組在感染90 d后，M2型巨噬細胞的特異性標志和基因的表達都升高；隨后在感染180 d后，表達量到達了峰值；在感染300 d后，它們的表達量都開始出現下降趨勢，卻依然保持在較高水平。表明在感染中后期，為了避免大量炎性細胞繼續加重組織的損傷，機體啟動了保護機制促使M2型巨噬細胞增殖，促進損傷的組織進行修復，抑制炎性細胞過強的作用；但同時也降低了其對病原體的殺傷能力，這也可能是導致泡球蚴逃避機體免疫功能的一個原因。

綜上所述，巨噬細胞在寄生蟲病中有著重要的免疫調節功能，因此我們在疾病進展的不同時期調控不同極化類型的巨噬細胞數量和比例，使其達到一個理想的狀態，從而使疾病在一定程度上得到控制，這可以為疾病的研究和治療提供一個新思路。本研究揭示了在泡球蚴感染中后期M2型巨噬細胞的變化，為下一步研究M2型巨噬細胞在泡型包蟲病中的調控機制的研究提供了理論依據。