全成分葡萄汁對D-半乳糖誘導小鼠的抗衰老作用

王曉波，宋俊科，張 雯，于子茹，王海港，周啟蒙，杜冠華

(中國醫學科學院&北京協和醫學院藥物研究所/北京市藥物靶點研究與新藥篩選重點實驗室，北京 100050)

D-半乳糖誘導衰老模型是目前較常用的衰老動物模型，其衰老反應接近于自然衰老[1]。葡萄中含有豐富抗衰老作用的白藜蘆醇等營養成分[2-5]，且主要存在于葡萄籽和葡萄皮中。本實驗分別采用普通榨汁法和破壁法制備普通葡萄汁和全成分葡萄汁，應用HPLC-MS測定2種葡萄汁中化合物的含量，利用D-半乳糖、焦糊食物和單蒸水建立小鼠衰老模型，考察2種葡萄汁的抗衰老作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1供試品 巨峰葡萄，產地為河北。

1.1.2實驗動物 小鼠80只，品系 KM，SPF級，雄性，體重33～35g，合格證號SYXK(京)2014-0023購買自斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0002。飼養于篩選中心通風鼠籠，適應性飼養3d，觀察小鼠狀態良好后，開始實驗。

1.1.3試劑 SOD、MDA和GSH-Px檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；D-半乳糖和PMSF，Sigma-Aldrich公司；蛋白裂解液、β-actin、Sirt1、Sirt6、p21、p53，CST公司；BCA蛋白定量試劑盒、高靈敏度化學發光檢測試劑盒、Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG，康為世紀公司；蛋白Marker，Thermo Scientific公司。

1.2 實驗儀器

JYL-Y8 PLUS營養破壁調理機(九陽，中國)；JYL-C051料理機(九陽，中國)；Agilent 1200高效液相色譜儀(Agilent，美國)；Agilent 6110單四級桿質譜儀(Agilent，美國)；Cascada TM LS water純水儀(Pall，美國)；Spectra Max M5酶標儀(Molecular Devices，USA)；熒光倒置顯微鏡(Nikon，Japan)；XS105 DU電子天平(Mettler Toledo，Swiss)；Vortex Genie 2渦旋震蕩儀(Scientific industries，USA)；MiniSpin常溫離心機(Eppendorf，Germany)；全自動生化儀(Toshiba，Japan)；STT-2小鼠跳臺儀、小鼠自主活動箱(中國醫學科學院藥物所)。

1.3 方法

1.3.1葡萄汁制備 全成分葡萄汁：準確稱取洗凈晾干的葡萄500g，加入250mL飲用水，放入營養破壁調理機中進行處理，轉速H級，時間20 s/次，共4次。

普通葡萄汁：準確稱取洗凈晾干的葡萄500g，加入250mL飲用水，放入料理機中進行處理，默認轉速，時間20 s/次，共4次。經過處理的葡萄汁以200目紗布進行過濾，獲得無明顯顆粒的葡萄汁，進行動物實驗。

1.3.2普通與全成分葡萄汁離心后沉淀重量比較 取10mL離心管稱重(W1)后加入5mL普通或破壁處理(全成分)的葡萄汁，稱重并記錄重量(W2)，以1 000r/min轉速離心20min，吸取上清液，稱取沉淀和管的重量(W3)。計算葡萄汁中固體沉淀物重量(W3-W1)。

1.3.3普通與全成分葡萄汁過200目篩后未濾過物重量比較 取1.5mL空EP管稱重(W1)后向空EP管中加入500μL葡萄汁，稱重并記錄重量(W2)，再用移液槍吸出葡萄汁過200目篩至同一EP管中，稱取EP管+濾過液體重量(W3)。計算未濾過物重量(W3-W2)。

1.3.4葡萄汁中化學成分檢測液相質譜條件 色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(3.5μm，2.1mm×100mm)，柱溫30℃，進樣量為10μL，紫外檢測信號288nm，流動相為含甲酸0.02%的水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫(表1)。

表1 梯度洗脫程序

質譜條件：質譜檢測采用的離子源為電噴霧離子源(ESI源)，采用負離子檢測模式，分別采用全掃描模式和單離子監測模式對潛在化合物進行預測。

質譜檢測參數為Fragmentor = 150 V；Gain = 1.5；Drying Gas Flow = 10.0L/min；Nebulizer Pressure = 35 psig；Drying Gas Temperature = 350°C；Capillary Pressure = 3 000(positive)，3 000(negative)。單離子監測模式監測的m/z見表2。

表2 單離子監測模式檢測的離子m/z和對應的目標化合物

1.3.5動物分組與給藥 80只小鼠隨機分為4組：正常對照組、模型組(衰老模型組)、普通葡萄汁組和全成分葡萄汁組。正常對照組動物每日皮下注射150mg/kg的生理鹽水，給予常規飼料飼養，自由飲水；其余3組動物每日皮下注射150mg/kg的D-gal溶液[4]，同時給予單蒸水代替自來水、120℃烘焙12 h后的飼料代替普通維持飼料，連續7w[4]。于造模的第3周開始，每天小鼠禁水2 h后分別自由飲用自來水和不同葡萄汁6 h。

1.3.6小鼠體重、飲水量與形態觀察 4組動物于每天給藥前稱重，記錄體重、飲水量、葡萄汁飲用量和小鼠形態變化。

1.3.7自主活動測定 將小鼠放入自主活動儀活動箱中，測定前每只小鼠先適應環境1min，然后由記錄儀自動記錄3min內小鼠自發活動次數。

1.3.8跳臺實驗 跳臺裝置為l0cm *10cm *28cm的被動條件反射箱，四周為黑色塑料板、底面鋪可通電的銅柵，每間內放置一高3cm、直徑4cm的橡皮墊作為動物回避電擊的安全區，先將小鼠放在反應箱內的橡皮臺上適應3min，然后立即通以40V交流電，小鼠自開始至第1次跳下橡皮臺的時間為潛伏期。小鼠跳下橡皮臺，受到電擊后逃避反應為跳上橡皮臺。記錄5min內小鼠跳下橡皮臺后受到電擊次數，稱為錯誤次數。小鼠于實驗開始前一天進行3次學習適應，24h后在底部銅柵通電情況下，直接將動物置于平臺上，記錄第1次跳下的潛伏期和5min內的錯誤次數。

1.3.9臟器指數的測定 取血后，取小鼠腦、肝、腎，取出后在生理鹽水中清洗表面的血跡，吸水紙上吸干水分，稱量重量并拍照，計算臟器指數。

1.3.10HE染色 每組取3只小鼠，用于腎臟病理檢測：腹腔注射10%水合氯醛(3.5mL/kg)麻醉。依次剪開皮膚、胸腔，充分暴露心臟，以灌注針穿透心尖，進入左心室，朝主動脈方向插入，用蠕動泵(調整流速為65r/min)輸注生理鹽水，于右心耳下部剪開右心房，至流出液變清，換用4%多聚甲醛溶液繼續灌注，至肝臟發白、動物全身僵硬為止，然后斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中繼續固定24 h。石蠟包埋，將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上連續切片，片厚4μm，進行蘇木素—伊紅(HE)染色。

1.3.11小鼠肝組織SOD、GSH-Px和MDA含量 迅速剝離各組小鼠腎臟，預冷的生理鹽水沖洗干凈，制備10%腎臟勻漿，3 000r/min，4℃離心10min，取上清。測定腎臟中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.3.12Western blot分析 Western blot法檢測Sirt1、Sirt6和p21等蛋白表達變化，提取組織、細胞總蛋白或用細胞核與細胞漿蛋白抽提試劑盒分別提取細胞核蛋白和細胞漿蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行定量。加入SDS上樣品緩沖液，沸水浴10min，以同等蛋白含量進行SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜，然后用5% BSA室溫封閉2 h，加入稀釋后的一抗，4°C孵育過夜；TBST洗3次，每次10min；加入相應的二抗稀釋液，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10min；用ECL發光法檢測不同樣品各種蛋白表達情況。

1.4 數據統計方法

實驗結果以Mean ± SD表示，應用GraphPad Prism 6.0統計軟件對各組數據進行處理，多組數據采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間差異采用Tukey’s post hoc test計算，兩組數據采用非配對t檢驗計算，P<0.05視為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 普通葡萄汁與全成分葡萄汁離心后沉淀物重量比較

由圖1可知，全成分葡萄汁離心后沉淀物的重量較普通葡萄汁中沉淀物的重量低(P<0.01)，表明葡萄經破壁處理后有更多物質混懸到溶液中，導致其沉淀重量較輕。

圖1 普通葡萄汁與全成分葡萄汁離心后沉淀物重量

2.2 普通葡萄汁與全成分葡萄汁過200目篩后未濾過重量比較

圖2 普通葡萄汁與全成分葡萄汁過200目篩未濾過顆粒重量

由圖2可知，經由200目篩過濾后，全成分葡萄汁未濾過顆粒重量明顯輕于普通葡萄汁未濾過顆粒重量(P<0.05)，表明全成分葡萄汁中的顆粒物質明顯少于普通葡萄中的顆粒物質，提示破壁處理得到的全成分葡萄汁更加細膩。

2.3 HPLC-MS法比較全成分與普通葡萄汁中化合物含量差別

2.3.1全成分與普通葡萄汁中白藜蘆醇相對含量比較從圖3A中可以明顯看出，全成分葡萄汁中白藜蘆醇的含量明顯高于普通葡萄汁中白藜蘆醇的釋放量，2種葡萄汁中的白藜蘆醇含量有顯著差異(P<0.01)。

2.3.2全成分與普通葡萄汁中山奈酚的相對含量比較從圖4A中可以明顯看出，全成分葡萄汁中山奈酚的釋放量遠遠高于普通葡萄汁中山奈酚的釋放量(P<0.05)。

2.3.3全成分與普通葡萄汁中槲皮素的相對含量比較從圖5A中可以明顯看出，全成分葡萄汁中槲皮素的釋放量遠遠高于普通葡萄汁中槲皮素的釋放量(P<0.05)。

2.3.4全成分與普通葡萄汁中蘆丁的相對含量比較從圖6A中可以明顯看出，全成分葡萄汁中蘆丁的釋放量顯著低于普通葡萄汁中蘆丁的釋放量(P<0.01)，這一結果與筆者預期的結果相反，但考慮到蘆丁屬于黃酮與糖的結合物(黃酮苷)，因此，猜測可能是在全成分與普通處理過程中，蘆丁可能脫掉糖分子，進而轉化為苷元的結果。而全成分與普通處理過程蘆丁轉化為苷元的效率不同，造成了實驗結果與預期結果相反。

2.4 小鼠葡萄汁飲用量統計

每天給予小鼠葡萄汁開始和結束時，使用量筒準確計量每組給葡萄汁的量，以體積表示，計算得出每只小鼠每天飲用葡萄汁量并比較兩組差異。圖7顯示，兩者在飲用量上無顯著性差異(P>0.05)，表明葡萄汁所起的藥效作用是相同劑量標準下的。

2.5 小鼠外觀狀態拍攝

造模及飲用葡萄汁7w后，對小鼠進行多方位拍攝，并觀察小鼠外觀及精神狀態。從圖8中可明顯看出，正常組小鼠毛色光亮柔順，精神狀態良好，健康活潑好動。衰老模型組小鼠，毛色發暗、臟亂，且有毛發稀疏的現象。同時，模型組小鼠萎靡虛弱，四肢無力，呈趴伏蜷縮態且有弓背現象，出現了顯著的衰老特征。全成分葡萄汁組小鼠與正常組小鼠基本相同，甚至更優于正常組。普通葡萄汁組小鼠的外觀及狀態介于正常組與模型組之間，說明葡萄汁對小鼠衰老模型所造成的外在狀態有改善作用，且全成分組優于普通組。

2.6 小鼠體重變化

統計每周小鼠體重并記錄，比較各組小鼠體重變化差異。從圖9中可以看出，實驗進行至第7周，隨著造模的進行，各組小鼠體重均有穩定增長，增長到峰值后略有波動，但最終各組小鼠體重差異無統計學意義。衰老模型在體重衰減方面與對照組無顯著性差異，給予葡萄汁也沒有影響小鼠的體重指標。

圖3 全成分與普通葡萄汁中白藜蘆醇相對含量比較A葡萄汁中白藜蘆醇含量；B白藜蘆醇標準品的選擇離子流色譜圖；C全成分葡萄汁選擇離子流色譜圖；D普通葡萄汁選擇離子流色譜圖([M-H]-，m/z=227)

圖4 全成分與普通葡萄汁中山奈酚相對含量比較A葡萄汁中山奈酚含量；B山奈酚標準品的選擇離子流色譜圖；C全成分葡萄汁選擇離子流色譜圖；D普通葡萄汁選擇離子流色譜圖([M-H]-，m/z=285)

圖5 全成分與普通葡萄汁中槲皮素相對含量比較A葡萄汁中槲皮素含量；B槲皮素標準品的選擇離子流色譜圖；C全成分葡萄汁選擇離子流色譜圖；D普通葡萄汁選擇離子流色譜圖([M-H]-，m/z=301)

圖6 全成分與普通葡萄汁中蘆丁相對含量比較A葡萄汁中蘆丁含量；B蘆丁標準品的選擇離子流色譜圖；C全成分葡萄汁選擇離子流色譜圖；D普通葡萄汁選擇離子流色譜圖([M-H]-，m/z=609)

圖8 小鼠外觀狀態

圖10 小鼠自主活動實驗結果

2.7 小鼠行為學改變檢測

2.7.1小鼠自主活動 4組之間采取平行試驗的方法，共4個暗箱，每次各取每組1只放入暗箱試驗。從圖10中可以看出，小鼠模型組自主活動與正常對照組相比顯著減少(P<0.01)，全成分與普通組均可增加小鼠的自主活動數，且全成分組的自主活動數多于普通組。

2.7.2小鼠跳臺實驗 從圖11A中可以看出，經過1d學習記憶之后，模型組與正常對照組相比潛伏期顯著縮短(P<0.001)，給予葡萄汁組與模型組相比潛伏期有所增加，其中，全成分葡萄汁組對潛伏期變短的改善有著顯著性的作用(P<0.05)。從圖11B中可以看出，模型組與正常對照組相比犯錯次數均增加(P<0.01)，給予葡萄汁組對犯錯次數有改善作用，其中，全成分葡萄汁組與模型組相比改善作用有著顯著性差異(P<0.05)。

2.8 小鼠肝、腎、腦臟器指數變化

取材時每只小鼠稱量體重及肝、腎(兩側腎)、腦3種臟器重量，計算得每只小鼠不同臟器指數，統計并計算差異。組織器官的重量，特別是腦、肝、腎等重要器官的重量變化是反映機體衰老程度的重要指標。從圖12A中可以看出，模型組小鼠與正常對照組相比，肝臟指數增加(P<0.001)，應為炎癥或水腫、充血所致，而全成分與普通組均有改善作用，其中全成分組的改善作用有顯著性(P<0.05)。各組小鼠腎臟器指數無明顯差異(圖12B)。另外，從圖12C中可以看出，全成分組與普通組相比，腦臟器指數有顯著性改善作用(P<0.05)。

2.9 小鼠肝臟組織抗氧化酶及氧化酶測定

SOD是一種存在于細胞液中的抗氧化酶，其活性的高低間接反映了組織抗氧化的能力[5]。從圖13A中可以看出，與正常對照組相比，模型組肝組織中SOD活性降低，給予葡萄汁組對此均有改善作用，其中全成分組葡萄汁有著顯著的改善作用(P<0.05)。GSH-Px是反映機體抗氧化能力的重要指標，進一步反映了小鼠衰老的情況。如圖13B所示，與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織中GSH-Px活性降低，全成分組相對于模型組能顯著提高GSH-Px水平(P<0.001)，并且全成分組的GSH-Px水平也顯著高于普通組(P<0.001)。MDA是機體內的自由基引發脂質過氧化的一種產物，常被作為評價衰老的一種指標。如圖13C，衰老模型組小鼠相對正常對照組MDA含量顯著增高(P<0.001)，全成分葡萄汁組相對于模型組可以顯著降低MDA的含量(P<0.001)，并且全成分葡萄汁組的MDA含量也顯著低于普通葡萄汁組(P<0.01)。

圖7 給葡萄汁兩組小鼠每天飲葡萄汁量

圖11 小鼠跳臺實驗結果A潛伏期；B錯誤次數

圖12 小鼠肝、腎和腦臟器指數變化A肝臟器指數；B腎臟器指數；C腦臟器指數

圖13 小鼠腎臟器氧化酶及抗氧化酶檢測A SOD；B GSH-Px；C MDA

2.10 小鼠腎臟HE染色病理切片

HE染色可見小鼠腎臟組織形態發生變化(圖14)，模型組小鼠與正常組小鼠相比，腎小球腫脹，出現明顯的體積增大和細胞增多，與周圍組織間隙變小(圖中箭頭所指位置)。腎小管上皮細胞出現細胞水腫，也就是常說的顆粒變性或空泡變性，且腎小管上皮細胞有壞死脫落和水腫，乃至腎小管管腔消失。全成分組與普通組上述病變形態均有一定改善，且全成分組優于普通組的改善情況。

圖14 小鼠肝臟HE染色病理切片

2.11 Western blot檢測不同蛋白含量

Western blot法測各組小鼠腦組織中FOXO3a、Sirt1、Sirt6、p53和p21蛋白表達水平。從圖14可以看出，模型組相對于正常對照組FOXO3a蛋白的表達顯著升高(P<0.001)，全成分組與普通組的FOXO3a蛋白表達量與模型組相比均有所降低(圖15A)。從圖15B中可以看出，模型組相對于正常對照組Sirt1蛋白的表達量顯著降低(P<0.01)，全成分組與普通組的Sirt1蛋白表達量與模型組相比均有所升高，其中，全成分組Sirt1蛋白表達量相對于模型組具有顯著性差異(P<0.05)。模型組相對于正常對照組p53蛋白的表達量顯著降低(P<0.01)，全成分組與普通組的Sirt1蛋白表達量與模型組相比均有所升高，其中，全成分組Sirt1蛋白表達量相對于模型組具有顯著性差異(P<0.05)(圖15B)。與正常對照組相比，模型組p53蛋白表達顯著降低(P<0.001)，全成分組與普通組的Sirt6蛋白表達量與模型組相比均略有所升高，且全成分組的作用更好(圖15C)。與正常對照組相比，模型組Sirt6蛋白表達有所降低，全成分組與普通組的Sirt6蛋白表達量與模型組相比均略有所升高，且全成分組的作用更好(圖15D)。從圖15E中可以看出，模型組相對于正常對照組p21蛋白的表達量有所增高，全成分組與普通組的p21蛋白表達量與模型組相比均有所降低。

3 討論與結論

葡萄是一種營養價值高的食物，其中所含有的白藜蘆醇等成分有著顯著的抗氧化、抗衰老作用[4-9]，但上述成分多存在于葡萄皮及葡萄籽中[1-3]。由于其口感粗糙生澀難以下咽，且食用后也不易于被人體消化吸收，常常被丟棄，不僅造成極大浪費，也難以發揮葡萄在生活中應有的抗衰老作用。破壁處理后的葡萄，能更多釋放出原本存在皮和籽中的上述抗衰老物質，更利于被人體消化吸收，發揮作用。本研究結果表明，全成分葡萄汁中更多的營養物質得以釋放而應用，其中，白藜蘆醇、山奈酚和槲皮素含量均顯著高于普通葡萄汁。

在對衰老的預防和治療研究中，鑒于小鼠基因和人類基因的相似性以及小鼠生命周期短暫，藥物的抗衰老活性研究多通過建立小鼠衰老模型來檢驗藥物的抗衰老效果。D-半乳糖注射法因其簡便易行，現多用于抗衰老試驗研究[1，10]。實驗小鼠皮下注射150mg/kg D-gal后，小鼠自主活動次數明顯減少；跳臺潛伏期顯著縮短、錯誤次數明顯增加；肝臟指數明顯增加，并引起的腎小球腫脹及腎小管上皮細胞水腫；抗氧化酶SOD的含量和GSH-Px水平顯著降低，脂質過氧化物MDA含量明顯升高；促衰老蛋白FOXO3a、p21的表達顯著升高而抗衰老蛋白Sirt1、Sirt6的表達水平顯著降低[11-13]。由此可見，應用D-gal皮下注射造成小鼠衰老模型，可以用來觀察不同葡萄汁的抗衰老作用。

連續7w分別給予2組實驗小鼠普通葡萄汁和全成分葡萄汁，均能夠增加D-gal導致的小鼠自主活動次數的減少，延長跳臺潛伏期、減少錯誤次數、提高小鼠學習記憶能力。飲用全成分葡萄汁能夠顯著改善D-gal導致的小鼠肝臟指數增加和腎小球腫脹及腎小管上皮細胞水腫的病理狀態，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px的含量，抑制脂質過氧化物MDA含量的升高，同時能夠降低促衰老蛋白FOXO3a、p21的表達，促進抗衰老蛋白Sirt1、Sirt6的表達。在相同飲用量的情況下，全成分葡萄汁抗衰老效果要優于普通葡萄汁。

以上實驗結果顯示，全成分葡萄汁能夠明顯抵抗小鼠的衰老反應，其抗衰老效果優于普通葡萄汁。這為日常抗衰老提供了一種行之有效的食療方法。◇

圖15 Western blot檢測不同蛋白含量A FOXO3a；B Sirt1；C p53；D Sirt1；E p21；F Western blot灰度圖