LAMP技術的染料、輔助劑的研究進展

賈曉曼,翟 浩,張 勇,馬亞男,李曉軍

(山東省果樹研究所,山東 泰安 271000)

病原物的檢測在醫學、農業、食品、海關等方面的需求極多,需要操作簡便、效率高、條件簡易、結果易觀察、實地性強的檢測方法,滿足快速檢測及現場檢測的工作需要。環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)便具有上述特點[1]。自LAMP技術產生以來,已經在多種病原物的檢測上得到應用。許多學者將LAMP與反轉錄、微流體、橫向流動試紙條等技術結合起來[2-4],展示了廣闊的發展和應用前景。本文從LAMP的原理、染料和助劑的選擇及研究進展方面進行了綜述。

1 LAMP的原理及檢測

1.1 LAMP的原理

LAMP技術由Notomi等[1]于2000年首次報道。在65 ℃左右條件下,DNA處于動態平衡狀態,可利用特異性引物及鏈置換DNA聚合酶,使鏈置換DNA不停地自我循環合成,終產物是含有若干反向重復目標片段和花椰菜結構的莖環DNA[1-5]。反應體系一般包括Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP、4條引物、模板DNA、輔助劑、Mg2SO4和染料等。反應中只需要Bst DNA聚合酶,即可在等溫條件下進行基因擴增[1-5],其動態原理圖可參考網站http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html。LAMP具有以下優點:擴增效率高,擴增時間短,在15～60 min內便可使DNA量放大109～1010倍;特異性較高,產生大量擴增產物及焦磷酸鎂沉淀,可通過觀察沉淀來判斷檢測目標基因序列的存在[6-7]。

1.1.1 引物設計 Notomi等發現目的DNA大小選擇在130～200 bp可獲得最好的結果,超過500 bp時擴增效果差,因此,包含F2和B2的目的片段應小于300 bp[1]。可用在線軟件Primer Explore (http://primerexplorer.jp/e/)確定引物區域及引物。圖1摘自Mori[8],其中正向外引物F3與F3c區域互補,內引物FIP由與F2c區互補的F2區和與F1c區相同的序列組成,環引物LF與F2/F1區域互補,反向引物B3、BIP、LB同理。

6個引物:F3、FIP、LF、B3、BIP、LB。6個區域:F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3。

LAMP引物應符合以下要求:F2和B2的5′端之間的距離為120～180 bp；F2、F3以及B2、B3間的距離為0～20 bp。成環區域(F2的5′到F1的3′,B2的5′到B1的3′)的距離為40～60 bp。Tm值在正常或富含GC的情況下為60～65 ℃,在富含AT的情況下為55～60 ℃[1]。依據F1c/B1c的5′末端和F2/B2及F3/B3的3′末端6 bp的dG值小于-16.75 kJ/mol的標準,來確定引物末端的穩定性。除引物區域外的目的DNA若存在限制性內切酶位點,則可用于確認擴增產物的特異性[8]。

4個引物在初始步驟中與目的DNA的雜交會影響LAMP的效率,應選擇合適的引物序列和長度,使Tm值在一定范圍內。F2、B2的Tm值宜在60～65 ℃之間,即Bst聚合酶的最佳溫度。Flc、Blc的Tm值應略高于F2、B2的,以便在從模板釋放單鏈DNA后立即形成環狀結構。F3、B3的Tm值應低于F2、B2的,以確保從內部引物起始的合成早于從外部引物起始的合成。此外，外引物與內引物的濃度比應在1/4～1/10[9]。也有研究者設計了環引物[8,10],環引物并非必需,但能將擴增時間縮短約1/3～1/2,可在30 min之內完成擴增[11]。

1.1.2 LAMP的反應過程 LAMP的反應過程如圖2所示,摘自Mori[43],分以下3個階段:

第一階段為起始材料生產階段。在60～65 ℃溫度條件、Bst聚合酶的作用下,引物FIP的F2序列與模板F2c區域結合向前延伸,引物F3與模板F3c結合置換出完整的FIP鏈,FIP鏈上的Flc與F1堿基配對形成環狀結構。引物BIP、B3的原理與引物FIP、F3類似,與FIP鏈結合延伸,最終產物兩端均能形成環狀結構,該啞鈴狀產物即LAMP循環擴增的起始模板。啞鈴狀產物有兩種,分別暴露F2c和B2c端,形成沒有先后,在整個反應體系中隨機發生。

第二階段為循環擴增階段。以啞鈴狀產物為模板,引物FIP、BIP分別與F2c、B2c區域結合,開始鏈置換合成,解離出的單鏈核酸也會在兩端形成啞鈴狀的結構。同時啞鈴狀產物以自身為模板,以3′末端的F1、B1區域為起點,進行DNA鏈置換及合成,形成新的莖環狀結構,產物長度增加1倍。引物FIP、BIP上的F2、B2區域也可與之結合,啟動新一輪的循環擴增。

第三階段為延伸再循環階段。引物FIP、BIP的F2、B2區域可以結合先前的產物進行擴增,產物也能以自身為模板進行合成,且產物長度增加1倍。由此下去,最終形成具有不同長度、不同數目莖環結構和反向重復序列的DNA混合物,電泳后呈現瀑布狀梯形條帶[1,10]。

1.1.3 LAMP的結果檢測 判定LAMP結果的方法主要有以下幾種:(1)Mg2+與從dNTP中析出的焦磷酸根離子結合,形成乳白色的焦磷酸鎂沉淀,可通過觀察是否產生白色沉淀,或應用實時濁度儀來監測反應結果[12-13],使擴增和產物檢測能夠一步完成;(2)加入染料觀察是否產生相應的顏色變化[14];(3)進行瓊脂糖凝膠電泳,看是否有典型的瀑布狀梯形條帶[1,10];(4)通過恒溫擴增微流控芯片實時觀察反應結果[15]。

染色檢測法因其直觀性和簡便性而最為常用。根據染料對反應是否產生抑制,染料可在反應后或反應前添加。但在反應后開蓋添加,易在空氣中產生氣溶膠,并在之后的檢測中造成假陽性。染料和輔助劑的種類都會對反應效率及結果判斷造成影響。因此,根據染料、輔助劑的作用特點進行合理的選擇及應用,對LAMP結果的正確性和可靠性有重要意義。

圖2 LAMP機制示意圖

1.2 染料的選擇

染料的種類有很多,應用較多的有3種:鈣黃綠素[10,16]、SYBR Green[17]和羥基萘酚藍[18-20](表1)。

由于不同染料的作用原理不同,加入的時間和用量也不同,作用條件、顏色變化也有差異,觀察者以個人標準判斷顏色差異也會對LAMP結果造成影響。因此,如何合理地選擇和使用顏料,是實驗人員面臨的重要問題。

1.2.1 鈣黃綠素 鈣黃綠素(Calcein)是一種絡合指示劑和熒光指示劑。Tomita等[16]用鈣黃綠素和氯化錳開發了一種有效的LAMP終點檢測方法。將鈣黃綠素溶于二甲基亞砜(DMSO)成5 mmol/L溶液,再用蒸餾水配制成0.5 mmol/L鈣黃綠素、10 mmol/L MnCl2的儲備溶液。鈣黃綠素通過與適量的Mn2+結合而熒光淬滅,隨著反應中產生的焦磷酸根離子與Mn2+生成沉淀,鈣黃綠素與Mg2+結合,又產生熒光[10]。應注意在低濃度的Mg2+條件下,酶活性降低,產物量下降,在Mg2+濃度過高時,會出現非特異性反應,所以應選擇合適的Mg2+濃度[21]。Loopamp熒光檢測試劑(LMP221)的主要成分為鈣黃綠素,并就其對紫外線的照射要求進行了研究,發現：當鈣黃綠素處于短波長(240 nm)到長波長(370 nm)時,產生黃綠色熒光；在中間波長(325 nm)的激發光下熒光最強；當激發光接近320 nm時,雖然從陽性樣品觀察到的熒光增強,但陰性對照的熒光也加強。因此,建議在短波長(240～260 nm)或長波長(350～370 nm)的激發光下進行LAMP可視熒光檢測,通過比較樣品與陽性、陰性對照的熒光強度進行判斷。

表1 染料的種類及使用量

1.2.2 SYBR Green I SYBR Green I的靈敏度較高,能結合到雙鏈DNA的小溝部分,加入后會影響酶的效果,所以宜在反應結束后加入。但在反應后開蓋加染料,產物會形成氣溶膠,引起產物或后續LAMP反應的污染,從而造成假陽性[17]。不少試驗人員選擇將SYBR Green I于反應前滴加于反應管的蓋上,反應后通過彈入或離心將染料與反應體系混勻,避免了對反應效率的影響及對產物的污染[22]。但需注意的是,在PCR儀開啟熱蓋的模式下,染料會變干凝固,不易回溶,所以宜采用水浴或PCR儀不開熱蓋的模式。SYBR Green I不能特異性地指示擴增產物,在存在引物二聚體或非特異性產物的情況下也有熒光,易造成假陽性,對引物的設計要求較嚴格[4]。

1.2.3 羥基萘酚藍 羥基萘酚藍(hydroxy naphthol blue, HNB)可與Mg2+結合而呈紫羅蘭色；隨著LAMP反應的進行,從dNTP析出的焦磷酸根離子與Mg2+生成沉淀,失去Mg2+的HNB變成天藍色,而陰性對照仍為紫羅蘭色,陰性和陽性結果差異明顯[22]。HNB在終濃度為120 μmol/L時對擴增沒有抑制,可在反應前加入[23]。反應可在96孔微孔板中進行,用酶標儀測量650 nm處的吸光度,體系中的HNB暴露于環境光超過2周,顏色仍然穩定[23]。陰性反應的結果與甜菜堿的使用與否有關,使用甜菜堿時,陰性反應呈紫羅蘭色,否則呈天藍色[24-25]。

上述3種染料相互比較,SYBR Green I和HNB的檢測靈敏度比鈣黃綠素高10倍,可能由于Mn2+的抑制,或者鈣黃綠素與DNA的相互作用引起鈣黃綠素靈敏度的降低[23]。

1.3 輔助劑的選擇

不同的輔助劑會對LAMP的效率和結果產生不同的影響,應根據輔助劑的作用特點進行合理的選擇及應用。在使用助變性劑提高PCR反應的特異性和避免異常產物擴增中,需將輔助劑的用量控制在對酶活性沒有抑制的范圍內[25]。在高GC含量靶序列的擴增時,模板所具有的高變性溫度會導致擴增效率降低,而助變性劑在降低Tm值和提高反應特異性方面有良好的效果[26-31]。

1.3.1 甜菜堿 DNA可能含有復雜的堿基(Py-G-C),使DNA聚合酶停滯而影響延伸。甜菜堿(Betaine)可通過提高富含GC區域的水合作用,影響DNA分子結構,降低堿基堆積力,增強DNA聚合酶的穩定性,幫助其順利沿模板延伸[32]。Spiess等[34]發現,甜菜堿也能減少RNA二級結構,降低RNA的Tm,保持逆轉錄酶的活性。甜菜堿能降低高GC含量序列的Tm值,使引物的Tm值接近,使反應更加容易進行[33]。魏洪巖等[35]發現,甜菜堿的有無對于檢測蘋果根結線蟲的LAMP擴增效果沒有明顯影響,且達到一定濃度后反而會抑制擴增反應,這主要是由擴增區域GC含量較低造成的。盧永燦[36]在擴增蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)和蘋果莖痘病毒(ASPV)時,甜菜堿的濃度為0～1.6 mol/μL時條帶有逐漸變亮的趨勢,當不加甜菜堿或所加濃度過高時,均不利于反應的進行。所以不同反應體系應對甜菜堿的濃度進行優化,以便達到最優產物量。

1.3.2 L-脯氨酸 研究發現,使DNA螺旋不穩定的化學物質能顯著提高LAMP的擴增效率。L-脯氨酸(L-Proline)跟甜菜堿一樣,能減少堿基積累[33,37-38],刺激反應的整體速率,也能增加對目的DNA的選擇性,并顯著降低無關序列的擴增,從而提高結果的特異性[1]。

1.3.3 其他輔助劑 Fukuta等在RT-LAMP試驗中采用了DTT,因為其中的巰基可以保護酶的二硫鍵,進而增加逆轉錄酶的穩定性[2]。也有研究者采用吐溫20或NP40來消除核酸提取殘留的SDS(0.01%及0.10%)的抑制作用[39]。也有研究者通過添加DMSO提高了檢測的特異性和靈敏度[40]。

1.4 假陽性的預防措施

在LAMP反應中,可通過以下幾點來避免假陽性的產生。

1.4.1 溶解液 不能使用含有螯合劑的緩沖液溶解鈣黃綠素,如TE緩沖液，因為與鈣黃綠素結合的Mn2+可被TE緩沖液中的乙二胺四乙酸(EDTA)螯合而產生熒光。此外,含有大量Ca2+和Zn2+的樣品也可能會造成假陽性的結果[41]。

1.4.2 紫外照射 反應管不能長時間暴露于紫外燈下,否則可能由于熒光背景的增加或熒光的猝滅而導致誤判。當紫外燈輸出太強時,陰性對照也像有熒光發射,此時可將紫外燈遠離反應管或改變反應管的角度,以便觀察陰性、陽性對照間的差異。

1.4.3 氣溶膠 在反應結束后,反應管盡量不開蓋,因為開蓋后產物會在室內形成氣溶膠,造成測試區域的污染。LAMP的靈敏度較高,染色法檢測易因氣溶膠而產生假陽性。可將加樣及開蓋電泳進行分區實驗,或使用封閉劑從而避免氣溶膠污染的產生。劉威[42]以熔點為40～55 ℃的全精煉石蠟作封閉劑,于試驗前加入,反應中封閉劑為液態,反應后為固態,將產物封閉于管底,杜絕了氣溶膠污染造成的假陽性。為了防止擴增產物分散,使用過的反應管不應開蓋,宜保持完全封閉,并用可密封的乙烯基袋子進行焚燒或雙層包裝,勿用高壓滅菌器處理。

2 LAMP技術的應用前景

LAMP技術不僅能實現對DNA的檢測,還可直接用RNA作模板,從而實現對病毒的檢測。在判定LAMP擴增結果的方法中,沉淀法和染色檢驗法會因觀察者的個體差異、顏色不明顯而造成肉眼觀察不便及誤判,也不能滿足高通量檢測的要求；運用恒溫擴增微流控芯片及實時濁度儀則需要購置昂貴的分析儀器。因此,許多學者都在尋找一種廉價、便捷、準確的判斷方法。

2.1 RT-LAMP

在檢測病毒時,因逆轉錄酶也存在鏈置換活性,可直接在LAMP體系中加入逆轉錄酶,即可在反轉錄的同時,完成對病毒的檢測[43]。RT-LAMP可實現對ACLSC、ASPV[36]、黃瓜花葉病毒[44]、番茄黃葉病毒(TYLCV)[45]等的監測。由于LAMP所用的酶對生物樣品中抑制物質的敏感性低,有助于節省樣品處理所需的時間和成本[8]。RNA提取可選擇簡單的方法,用400 μL 0.5 mol/L NaOH研磨100 mg組織,直至沒有大片組織。從該提取物中快速轉移10 μL至含有490 μL 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)的新管中,充分混合,并取1.5 μL到25 μL反應體系中,用于RT-LAMP試驗[39,46-47]。

2.2 LAMP+紙質微流體技術

2007年Whitesides團隊[48]首次提出的紙質微流體技術,又稱微流控紙基分析設備(Microfluidic pape-based analytical devices, μPADs),簡稱紙質芯片[3],是近幾年微流控芯片發展的新方向。LAMP與紙質微流體技術結合,有助于實現低資源環境下基因即時檢測系統的使用[8]。紙質芯片以濾紙或層析紙為材料,通過切割或疏水材料處理制成含微通道的2D設備,或通過堆疊、折疊制成3D設備。將LAMP技術與芯片整合,通過儀器傳感定量檢測或肉眼觀察檢測,可同時檢測多個基因和樣本,完成對病原菌的高通量檢測,簡便低廉,在現場檢測等資源有限的條件下也可進行[49]。

2.3 LAMP-LFD

LAMP-LFD通過LAMP技術與橫向流動試紙條技術(Lateral flow dipstick, LFD)相結合,使LAMP結果更加直觀。Sano等[50]建立的檢測微量抗原技術是LFD的基礎,LAMP-LFD技術結合了分子生物學手段和免疫層析技術。在LAMP反應結束后,將試紙條直接插入到緩沖液和擴增產物的混合溶液中5～10 min,由生物素標記的LAMP產物與由異硫氰酸熒光素(FITC)標記的探針特異性雜交形成免疫復合物,由于層析作用而擴散,與試紙條上具有生物素抗性的檢測線結合而顯色,未雜交的探針和抗體形成二元復合物,繼續擴散并與質控線結合顯色。LAMP-LFD最低可檢測5 pg的DNA[51],具有結果直觀、靈敏度高、設備簡單、成本低的優點,可應用于病毒、細菌、真菌、轉基因產品的檢測等[4,35]。

3 總結

LAMP技術所需設備簡單,反應速度快,反應結果特異性高,易判定。染料法檢測雖然結果直觀,但不同的染料對操作的要求不同,需注意區分；染料法也可以結合吸光度檢測、沉淀觀察、電泳等進行檢驗。應根據目的DNA的GC含量等實際情況選擇輔助劑的添加濃度,以免抑制反應的速率。LAMP與紙質微流體、LFD等技術相結合,使其應用更加便利和廣泛,可視化程度增加,在農業病害檢測、食品安全檢測、海關檢驗檢疫中的應用前景更加廣闊。