植物過敏性反應分子機制研究進展

向婧姝

(貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004)

植物隨時面臨著自然界各種各樣的威脅，卻不能像動物一樣通過移動來躲避，但在與病原物長期的相互博弈中僅有少數植物被成功侵染，這是因為植物在長期的進化過程中形成了一套有效的免疫防衛機制[1]。

植物外表皮有角質層、蠟質層、細胞壁等物質覆蓋，組成了一道天然屏障，抵御了大部分病原微生物的侵襲。這道屏障是植物的第一道防線，又稱被動抗性，對所有的病原物都有效[2]。植物的免疫反應，又稱主動抗性，是在被病原物侵染后誘發的，主要有先天免疫反應和后天免疫反應2類,先天免疫反應包括病原物相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)激發的免疫反應(PAMP-triggered immunity, PTI)、效應因子(effector)激發的免疫反應(effector-triggered immunity, ETI)[3]；后天免疫反應也有2類：系統性獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)[4]和誘導系統抗性(induced systemic resistance, ISR)[5]。

當病原物突破植物的第一道防線后，位于細胞膜上的模式識別受體(patten recognition receptors, PRRs)能夠識別PAMPs，激發植物的免疫反應PTI[6]。PAMPs是病原微生物的重要組成部分，是在進化上高度保守的分子結構，例如鞭毛蛋白、延伸因子、幾丁質等[7]。病原物會產生效應因子來干擾PTI，導致植物感病，稱為效應因子激發的感病性(effector-triggered susceptibility, ETS)。但同時植物也有響應機制，植物進化出了專一性識別效應因子的抗性基因(resistance gene,R基因)，其編碼的蛋白具有核苷酸結合結構域和亮氨酸重復區(nucleotide binding, NB和leucine rich repeat, LRR domains，即NB-LRR結構)。該蛋白能夠專一性識別病原物的效應因子，激發植物的ETI免疫反應，ETI可以加速并放大PTI反應，導致植物產生抗病反應，同時在侵染點附近會產生局部的細胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)來抑制病原物擴散，即過敏性反應(hypersensitive response, HR)。病原物會繼續進化出新的效應因子來避免植物的ETI反應，而植物也會隨之進化出新的抗性蛋白來識別[8]。Jones等(2006)據此提出了一個拉鏈模式(zigzag model)來解釋植物與病原物的互作過程[8]，如圖1所示。

圖1 植物與病原物互作的拉鏈模式

1 植物過敏性反應

病原物與植物的相互作用有2種：親和互作(compatible interaction)引起植物感病；不親和互作(incompatible interaction)導致植物抗病。植物過敏性反應(hypersensitive response, HR)是植物與病原物不親和互作時，植物產生的一種防衛反應。過敏性反應這一概念最早由Stakman(1915)提出，用來描述銹病在其谷類抗病品種上形成的快速、局部的植物細胞死亡[9]。后來人們研究發現HR反應與植物的抗病性相關，在植物遭受病原菌侵襲后，植物受侵染點以及鄰近組織快速壞死，從而限制病原菌的生長[10]。植物過敏性反應是一種細胞程序性死亡(PCD)，主要包括植物識別病原菌、植物細胞死亡、抗病反應的激發、病原菌生長的抑制這4個方面[11]。

根據Flor(1971)提出的“基因對基因”假說[12]，植物R基因編碼的產物特異性地識別病原物無毒基因(avirulence gene)編碼的產物并相互作用，在侵染點就會產生過敏性反應[13]。目前已經有很多研究證實了這一假說，Tang等(1997)發現番茄抗性基因Pto產物和無毒基因AvrPto編碼產物在分子水平互作[14]；Jia等(2000)利用酵母雙雜交系統研究發現稻瘟菌的無毒基因AvrPita和水稻抗性基因Pita也能互作[15]；Leister等(2000)發現擬南芥抗性基因RPS32蛋白和無毒基因AvrRpt2表達產物在葉肉的原生質體中瞬時表達時會發生免疫共沉淀[16]。

除了無毒基因編碼的產物會在植物上引起過敏性反應外，一些激發子(elictor)也能引起HR反應，激發植物的抗病反應。Wei等(1992)從梨火疫病菌中分離到的蛋白質激發子harpin，能引起煙草的過敏性反應[17]。Kulye等(2012)從極細鏈格孢菌(Alternariatenuissima)中分離出一個蛋白質激發子Hrip1，能引起煙草的過敏性反應，并增強對煙草花葉病毒(TMV)的抗性[18]。Chang等(2014)從寄生疫霉上分離到一個蛋白質激發子OPEL，可以在煙草上引起HR，并增強植物的基礎抗性[19]。

過敏性反應發生的同時，時常會伴隨著一些相關的抗性事件，例如活性氧爆發、離子流、一氧化氮的產生、胼胝質積累、細胞外pH值升高、細胞壁木質化加厚、病程相關蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs)的表達等[20-21]。這些抗性反應最早出現在侵染點細胞，爾后擴散到鄰近的沒有被侵染的細胞，最后擴散到整株植物產生SAR抗性反應，使得植物能夠抵抗多種病原物[22]。

2 活性氧與植物抗病

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一類高氧化性物質的總稱，主要包括過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)、羥基自由基(·OH)、單線態氧(1O2)、脂氫過氧化物(ROOH)等，主要來源于葉綠體和線粒體的一些酶促反應[23]。

植物自身有著良好的酶促清除系統和非酶清除系統，ROS在植物體內通常處于一種動態平衡狀態，以維持植物自身正常的生理代謝[24]。當植物遭受到來自外界環境(如逆境、病原物侵害等)或自身的氧化脅迫時，活性氧會在植物體內大量積累。ROS作為有氧代謝副產物會對植物產生毒害作用[25]，高濃度時甚至會造成植株死亡。但是活性氧同時也是一種信號分子，它作為第二信使調節著植物的新陳代謝。例如H2O2對擬南芥etr1-7乙烯受體功能缺失突變體中的氣孔關閉起到干擾作用[26]。

活性氧爆發被認為是植物與病原物互作的早期事件之一，Doke(1983)首先發現在病原物與植物的非親和性互作中會產生大量的ROS[27]。他用致病疫霉(Phytophthorainfestans)接種馬鈴薯，在發生過敏性反應的同時檢測到了活性氧的產生，在不能引起過敏性反應的馬鈴薯中沒有檢測到活性氧，因此他認為ROS的產生與過敏性反應有直接的關系[27]。這一觀點在后來的許多研究中得到證實。Vera-Estrella等(1992)用番茄葉霉病菌(Cladosporiumfulvum)侵染番茄，從發生HR反應的番茄葉片中提取細胞液感染同種番茄的懸浮細胞，產生了大量活性氧；但用沒有發生HR反應的番茄葉片細胞提取液感染番茄懸浮細胞，其活性氧水平卻不會升高[28]。Baker等(1993)用火疫病菌(Erwiniaamylovora)侵染煙草懸浮細胞后產生了Harpin蛋白，引起過敏性反應，并產生活性氧爆發，然而用不能產生Harpin蛋白突變體侵染煙草則不能引起活性氧爆發[29]。目前普遍認為過敏性反應中活性氧的產生與植物中的還原型輔酶Ⅱ(NADPH氧化酶)有關，并受鈣離子調控[30]。Taniguchi等(2001)發現因病毒侵染煙草和番茄產生O2-的酶位于質膜上，可以與NADPH氧化酶的抗體反應，并且該酶活性受Ca2+調節[31]。Schwacke等(1992)用真菌侵染云杉細胞，發現除去培養介質里的鈣離子會減少懸浮細胞中的活性氧水平，因此認為Ca2+與ROS的爆發相關[32]。

活性氧在植物過敏性反應中起了重要作用。首先，ROS在被侵染部位大量積累能直接毒害病原菌，降低其存活力。Keppler等(1989)用Pseudomonassyringaepv.syringae細菌侵染煙草懸浮細胞后產生了大量活性氧，明顯減少了細菌數量，但在加入SOD活性氧清除劑后細菌數量又增加了，同時延緩了HR[33]。其次，加固細胞壁結構，H2O2可以引發細胞壁木質化，增強細胞壁強度，從而抵抗病原物入侵[34]。第三，活性氧可以誘導植保素(phytoalexin, PA)合成，植保素是在植物受到侵染或外界環境脅迫時產生的一類分子量較低的抗微生物化合物[35]。有研究發現，OH-和H2O2可以誘發大豆素的合成[36]，O2-可以誘發馬鈴薯合成日齊素[37]，而外源CAT和SOD等自由基清除劑可以抑制植保素的合成[38]。最后，活性氧能調控基因表達。ROS可以在轉錄水平上調控防衛相關基因的表達，Desikan等(1998)發現H2O2能夠誘導擬南芥懸浮細胞中如谷胱甘肽轉移酶(GST)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的表達[39]。

3 胼胝質沉積

胼胝質(callose)的主要成分是β-l,3-葡聚糖，存在于植物花粉管細胞、韌皮部篩板、細胞壁和胞間連絲中，在植物的生長發育中起著重要的作用[40]。當植物受到各種脅迫時，胼胝質可以通過沉積或降解，調節胞間連絲瓶頸的膨大或收縮[41]。而當病原物侵染植物時，胼胝質會在細胞壁沉積，增強細胞壁結構，從而抵御病原物入侵并抑制病原物的傳播擴散[42]。Shimomura等(1975)在TMV侵染粘毛煙草(Nicotianaglutinosa)后20 h(形成壞死斑前)的葉表皮細胞壁上觀察到了胼胝質沉積，壞死斑出現后依然能觀察到大量的胼胝質[43]。Luna等(2010)用Flg22處理水培擬南芥后，在葉片中檢測到了胼胝質[44]。Chang等(2014)從寄生疫霉中分離到蛋白質激發子OPEL，其能在煙草上引起過敏性反應，用其處理煙草后能檢測到胼胝質沉積[19]。因此，胼胝質沉積也被認為是植物防御反應發生的一個重要標志。

4 防御相關酶

植物與病原物不親和互作引發過敏性反應，植物體內一些抗病相關的防御酶活性也會發生變化，有研究表明防御相關酶活性的提升可以提高植物的抗病能力。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是一種普遍存在于植物、昆蟲、真菌中的含銅金屬蛋白酶，廣泛分布于植物的各個組織中，一般在幼嫩組織中含量較高[45]。PPO由核基因編碼，在細胞質中合成，爾后轉運到質體中行使其功能[46]。當植物組織遭到病原物侵襲時，質體內的多酚類物質會被PPO氧化生成琨類物質，從而發揮抗病作用。天然狀態下的多酚氧化酶與內囊體膜結合而沒有活性，只有當植物遇到外界刺激時PPO才會被激活與內囊體膜分離來發揮抗病作用。Bu等(2014)用蛋白質激發子PevD1處理棉花，誘導其系統抗病性，多酚氧化酶的活性在處理24 h后開始上升，在120 h時達到高峰，比對照組的活性高3～4倍[47]。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是減輕氧化脅迫機制中的一種重要酶，廣泛存在于動植物和微生物體內。植物在正常的生理情況下會不斷產生活性氧，但同時也會不斷地清除活性氧以維持動態平衡，這有賴于植物體內良好的酶促清除系統，起關鍵作用的主要有超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶(catalase, CAT)等，其中SOD起主要作用[48]。在過敏性反應中，植物會在瞬間產生大量活性氧而導致細胞死亡，限制病原菌擴散，而同時SOD活性也會升高，從而削弱活性氧和病原菌代謝產物對植物細胞的傷害。Sgherri等(2013)發現葡萄感染了葡萄扇葉病毒后，不僅引發活性氧大量積累，SOD的活性也會上升[49]。

5 病程相關蛋白

病程相關蛋白(pathogensis-related proteins, PRs)是植物受到病原物或外界脅迫時誘導表達的一種蛋白質，在植物的防御反應中起著重要作用[50]。Van Loon等(1970)首次發現了病程相關蛋白，他們在2個煙草品種上接種TMV引起過敏性反應時發現了4種新的蛋白質[51]。隨著研究的深入，許多研究者從不同植物中發現了類似的蛋白。Antoniw等(1980)將這些蛋白命名為病程相關蛋白，同時提出了命名方法[52]，此后病程相關蛋白的研究得到了極大的發展。迄今為止，已經鑒定了17個家族的病程相關蛋白。

病程相關蛋白與植物的抗病反應息息相關，PRs首先在煙草對TMV的過敏性反應中被發現[51]，此后的研究也發現其與植物誘導抗性有關。Czernic等(1996)發現煙草和茄假單胞桿菌(Pseudomonassolanacarum)不親和互作時，一個過敏性反應相關基因hsr在HR中被激活[53]。Wang等(2015)用從側短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)分離到的激發子蛋白PeBL1處理煙草，能引起過敏性反應，并提高了煙草的系統抗性，同時檢測到了病程相關蛋白的表達[54]。

不同的病程相關蛋白的功能也不盡相同，例如PR-1a、PR-5基因是水楊酸途徑的標志基因。煙草的PR-1a蛋白的表達與煙草的系統獲得抗性密切相關，Alexander等(1993)把PR-1a基因轉到煙草中表達，結果發現PR-1a的高效表達增強了煙草轉基因植株對煙草霜霉病和煙草黑脛病的抗性[55]。PR-5蛋白是一種類甜蛋白，具有激活植物防衛信號途徑及抵抗真菌侵染等作用[56]。PDF1.2則是茉莉酸/乙烯信號途徑的標志基因。NPR1基因是各信號途徑的交叉點，在正常情況下處于失活狀態，當受到外界刺激時被激活，通過與轉錄因子TGA互作，參與PR基因和植物抗病性的調控[57]。

6 小結與展望

植物在與病原物的長期博弈過程中，進化出了一套有效的免疫防衛機制。過敏性反應是植物抗病的典型表現，通過將病原物限制在侵染點，從而抑制其擴散。活性氧爆發、胼胝質沉積、防御相關酶、病程相關蛋白的產生是過敏性反應的重要標志，通過檢測這些標志可以判斷過敏性反應的發生。過敏性反應是無毒基因與抗性基因互作的結果，通過尋找抗性基因，可以深入了解植物抗病的信號轉導機制，并且應用于作物的遺傳改良，逐步取代化學防治的方法，解決環境污染、農藥耐藥性等問題。