利用復合酶結合超聲法提取沙棘葉黃酮

陳 春

(山西省林業科學研究院，山西 太原 030012)

1 引言

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)是胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(HippophaeLinn.)多年生灌木。沙棘富含多種營養成分和活性物質，其中沙棘黃酮具有抗氧化延遲衰老、增強免疫功能、調節血糖血脂、抑制腫瘤生長、抗心血管疾病等藥理作用[1]。研究表明沙棘葉黃酮含量明顯高于果實，并且沙棘葉利用成本遠低于沙棘果實[2]。

黃酮主要的提取方法包括：水提取法、有機溶劑提取法、微波輔助提取法[3]、超聲波輔助提取、酶提取法等[4～6]。本研究將乙醇提取法、超聲輔助提取法[7]和復合酶提取法[8]相結合，目的是通過實驗獲得最佳的提取工藝條件，為沙棘葉黃酮提取的生產和研究提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 沙棘葉片

沙棘葉片采摘于山西省關帝山國有林管理局三道川中心林場龍興工區。

2.1.2 實驗用試劑和酶

本實驗主要試劑包括：蘆丁標品，批號: 100080-200707，中國藥品生物制品檢定所；復合酶由寧夏和氏璧生物技術有限公司生產；果膠酶由國藥集團化學試劑有限公司生產；其它試劑均為分析純試劑。

2.1.3 實驗儀器

實驗過程中主要用到的儀器設備有：GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司)；QE-500高速粉碎機(浙江屹立工貿有限公司)；SB25-12超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；721紫外可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

2.2 試驗方法

2.2.1 樣品的預處理

將采摘的沙棘葉置于干燥箱中，在60 ℃溫度條件下干燥24 h，取出干燥后的沙棘葉片去掉小枝，用粉碎機將沙棘葉片粉碎后過40目篩，裝入樣品袋，放入干燥器中保存備用。

2.2.2 標準曲線的制作

2.2.2.1 對照品標準溶液配制

總黃酮對照品標準溶液的制備：用萬分之一天平上稱取蘆丁20 mg,用60%乙醇將蘆丁通過水浴微熱使溶解于100 mL容量瓶中,加適量,冷卻至室溫后,繼續添加60%乙醇定容，得到蘆丁濃度為0.2 mg/mL標準溶液。

2.2.2.2 標準曲線的制作

吸取0.2 mg/mL蘆丁標準溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL于25 mL容量瓶,依次分別加入30%乙醇至6 mL、5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL、0 mL，搖勻；繼續加入1 mL的5%NaNO2溶液,搖勻后靜置6 min；加入1 mL的30%Al(NO3)3溶液,搖勻靜置6 min；最后加入10 mL的10%NaOH溶液,加30%乙醇至刻度,搖勻靜置15 min。在波長為510 nm處測定吸光度。曲線X軸為蘆丁的梯度濃度值,Y軸為對應的吸光度值,繪制標準曲線。

2.2.3 沙棘總黃酮含量測定

將沙棘葉黃酮提取的液渣混合物過濾除去葉渣，用移液槍吸取1 mL提取液于25 mL容量瓶,然后利用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法在波長為510 nm條件下測定吸光度。根據樣品中黃酮含量(mg/g)=(c×d×v)/r的公式計算，c為通過標準回歸方程計算所得質量濃度(mg/mL),d為稀釋倍數,v為提取液總體積(mL)，r為沙棘葉粉的重量(g)。

2.2.4 沙棘葉提取單因素影響試驗

2.2.4.1 用酶量對沙棘葉黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，液料比20∶1,加入60%乙醇10 mL,超聲功率200 W,提取溫度50 ℃,提取時間60 min,酶用量分別是沙棘葉粉質量的1%、2%、3%、4%、5%和6%的梯度條件下提取沙棘葉總黃酮。

2.2.4.2 溫度對沙棘葉總黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，液料比為20∶1，加入60%乙醇10 mL,設置超聲功率200 W,提取時間60 min,提取用酶質量百分比為沙棘葉粉質量的4%，在提取溫度20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的梯度溫度下提取沙棘葉總黃酮。

2.2.4.3 時間對沙棘葉總黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，液料比為20∶1，加入60%乙醇10 mL,設置超聲功率200 W,酶質量百分比為沙棘葉粉質量的4%，提取溫度50 ℃,在提取時間為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、 80 min的梯度條件下提取沙棘葉總黃酮。

2.2.4.4 超聲功率對沙棘葉總黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，液料比為20∶1，加入60%乙醇10 mL,酶質量為沙棘葉粉質量的4%，提取溫度50 ℃,提取時間為60 min，分別設置超聲功率為200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W、500 W梯度條件下提取沙棘葉總黃酮。

2.2.4.5 液料比對沙棘葉總黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，酶質量為沙棘葉粉質量的4%，提取溫度50 ℃,提取時間為60 min，設置超聲功率為200 W，在液料比為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1梯度條件下提取沙棘葉總黃酮，即分別加入60%乙醇5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL。

2.2.4.6 乙醇濃度對沙棘葉總黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，酶質量為沙棘葉粉質量的4%，提取溫度50 ℃,提取時間為60 min，設置超聲功率為200 W，在液料比20∶1，分別加入10 mL體積百分比濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇提取沙棘葉總黃酮。

2.3 數據處理與分析

本實驗利用軟件Origin2017軟件處理分析實驗數據并繪制數據圖。

3 結果與分析

3.1 標準曲線的繪制

如圖1所示即為蘆丁吸光度標準曲線，由軟件origin 2017經線性回歸得回歸方程y=-7.03571E+12.1799X，相關系數R2=0.99937，在0.008 mg/mL～0.06 mg/mL區間范圍內線性回歸關系良好。

3.2 單因素試驗結果分析

3.2.1 提取用酶量對沙棘葉黃酮提取的影響

如圖2所示，通過在超聲輔助條件下利用乙醇對沙棘葉黃酮的提取過程中，添加酶會有效提高沙棘葉黃酮的提取效率，通過改變酶相對于沙棘葉粉的質量百分比，進一步研究沙棘葉黃酮提取效率同酶用量的關系。從圖2可知，添加復合酶5%時，提取效率最高，添加果膠酶6%時，提取效率最高。

圖1 蘆丁吸光度標準曲線

圖2 酶質量百分比對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.2.2 溫度對沙棘葉總黃酮提取的影響

由圖3可以看出，提取沙棘葉黃酮時無酶添加情況下，隨著溫度的升高沙棘葉黃銅的析出逐漸增大，當提取溫度增加至60 ℃時再繼續增加溫度對提取率變化不明顯。在添加復合酶和果膠酶單酶的條件下，溫度為50 ℃，提取率均達到最大，之后由于溫度的升高讓酶的蛋白質結構發生變性影響到對酶解反應的生物催化作用，提取率呈下降趨勢。

圖3 溫度對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.2.3 時間對沙棘葉總黃酮提取的影響

由圖4可以看出，隨著提取時間的延長，沙棘葉總黃酮析出量將不斷增大，當達到70 min以上時，沙棘葉總黃酮含量將再基本保持不變。從圖中可以看出，當提取時間為60 min時，添加復合酶和果膠酶，提取黃酮的含量均達到最大值，并且添加復合酶的提取效率高于果膠酶。

圖4 時間對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.2.4 超聲功率對沙棘葉總黃酮提取的影響

由圖5所示，根據超聲的功率設定范圍從200～500 W，從圖中可以明確看出在使用酶輔助的條件下沙棘葉黃酮提取率高于無酶添加，并且復合酶的提取效率高于單酶果膠酶，均在300 W時達到最大提取效率。

圖5 超聲功率對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.2.5 液料比對沙棘葉總黃酮提取的影響

由圖6所示，添加復合酶輔助提取沙棘葉黃酮時當液料比為30∶1時，提取效果最好；使用果膠酶時液料比為20∶1提取率最高。無酶添加時隨著液料比的增加，沙棘葉黃酮提取效率不斷增加，當達到液料比為40∶1和50∶1時基本沒有變化。

圖6 液料比對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.2.6 乙醇分數對沙棘葉總黃酮提取的影響

由圖7可知，在使用生物酶輔助提取沙棘葉黃酮的過程中，隨著乙醇體積分數的增加，沙棘葉黃酮的析出均是先快速提高，復合酶在乙醇體積濃度為50%，果膠酶在30%達到最大提取效率，然后再緩慢降低，主要原因是高濃度的乙醇能使蛋白變性從而使酶失去活性。在無酶條件的對照組可以看出，隨著乙醇濃度升高沙棘葉黃酮的提取效率呈正相關，但當乙醇的體積分數為70%，隨著乙醇體積分數增加沙棘葉黃酮提取效率基本不變。

圖7 乙醇體積分數對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.3 單酶和復合酶對沙棘葉黃酮提取的對比

從圖3～7的多個單因素對沙棘葉黃酮提取影響的對比實驗可以看出，提取沙棘葉黃酮過程中添加酶可以有效提高沙棘葉中黃酮的提取率，同時添加復合酶對沙棘葉總黃酮的提取要明顯優于添加果膠酶單酶。

4 討論與結論

(1)通過將乙醇提取法、超聲提取法、酶提取法3種沙棘葉提取方法結合，可以有效提高沙棘葉黃酮的提取效果，并且不會引入有毒有害物質，提取液易于分離回收，具有很好的生產實踐意義。

(2)通過實驗優化后的提取條件：使用復合酶，酶質量百分比5%，時間60 min，超聲功率300 W，溫度50 ℃，乙醇體積分數50%，液料比30∶1。在優化后的提取條件下，提取沙棘葉黃酮。在優化后的提取條件下，提取沙棘葉總黃酮，最后的得率為1.78%。

(3)通過兩種不同的酶作用于沙棘葉，復合酶和果膠酶。其中復合酶成分包括果膠酶、半纖維素酶、阿拉伯聚糖酶、β-葡聚糖等酶，由于酶之間有較強的協同作用，相互促進，加速細胞結構的分解，促進黃酮類物質進一步釋放，復合酶提取沙棘葉黃酮的效果優于果膠酶單酶。因此在相同的條件下優選添加復合酶作為輔助來提取沙棘葉總黃酮，可以節約酶的使用量，降低提取成本，提高提取沙棘葉黃酮的提取率。

ExtractionofFlavonoidsinSeaBuckthornLeavesbyUsingCombinedEnzymeAssistedwithUltrasonicMethod

Chen Chun

(ShanxiAcademyofForestSciences,TaiyuanShanxi, 030012,China)

Abstract: Sea buckthorn (Hippophaerhamnoides L.) leavesare rich in many active components,among which the flavonoids have high health care and medical value.In this study, the total flavonoids in the leave of Sea buckthorn are extracted by using the combined enzyme assisted with ultrasonic method. Through the single-factor experiments, the extraction of flavonoids in leaves has been optimized. The experiment results indicate that the optimum extraction conditions for flavonoids aremass percentage of the combined enzyme 5%,60min, ultrasonic power300w, temperature50℃, ethanol volume fraction 50%, and liquid-solid ratio30:1. The experiment also shows extraction efficiency of combined enzyme is significantly higher than individual enzyme.

Keywords: sea buckthorn leaves;Flavonoids; ultrasonic method; complex enzyme