發熱伴血小板減少綜合征患者核衣殼蛋白特異性IgM水平與病情嚴重程度的相關性

常海燕，嚴曉敏，張昭萍，吳衛華，賈 蓓，吳 超

（南京醫科大學鼓樓臨床醫學院，江蘇 南京 210008）

發熱伴血小板減少綜合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是由發熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTS virus，SFTSV）引起的新發傳染性疾?。?－3］。在SFTS的發病過程中，活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、血清清蛋白水平、SFTSV-RNA載量、年齡等已被證明是影響SFTS患者預后的獨立危險因素［4－6］。SFTSV-RNA 基因主要表達核衣殼蛋白（N蛋白）、Gn和Gc糖蛋白，其中N蛋白是最具免疫原性的抗原，N蛋白特異性抗體在抗病毒過程中通常發揮著關鍵作用［7－8］。然而，在SFTSV所致的SFTS發病過程中，N蛋白IgM抗體的動態變化及與病情的關系尚不清楚。

本研究回顧性分析了SFTS患者N蛋白特異性IgM（－）組與IgM（＋）組患者的臨床癥狀，并分析了N蛋白特異性IgM抗體水平與實驗室檢查結果、病情嚴重程度的相關性，旨在為揭示N蛋白特異性IgM抗體在SFTS發病過程中的作用提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月—2017年11月在某院住院治療的SFTS患者為研究對象。從病歷系統中提取患者的住院信息（包括臨床癥狀），從檢驗系統中獲取其實驗室檢查結果。納入標準：符合發熱伴血小板減少綜合征防治指南（2010版）的標準：（1）急性病程，體溫＞38℃；（2）有蜱蟲接觸史或與SFTS患者有密切接觸史；（3）血小板或白細胞計數減少；（4）SFTSV核酸陽性。納入患者均自愿參與研究并簽署知情同意書，且已征得南京鼓樓醫院倫理管理委員會審批同意。

1.2 研究方法

1.2.1 病例分組 收集30例SFTS患者的臨床癥狀及實驗室結果，根據其在發病2周時N蛋白特異性IgM抗體定性結果將患者分為IgM（＋）組與IgM（－）組；根據患者病情嚴重程度分為輕癥組及重癥組；重癥患者的定義參考Deng等［1］的研究，任何需要入住重癥監護病房并且至少符合以下標準之一的患者均納入重癥患者組：（1）急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征；（2）心力衰竭；（3）急性腎衰竭；（4）腦炎；（5）休克；（6）敗血癥；（7）彌散性血管內凝血（DIC）；（8）死亡。

1.2.2 試驗方法

1.2.2.1 SFTSV-RNA 載量的檢測 收集SFTS患者急性發病期（每隔2 d）血清，使用RNA提取試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany）從血清樣品中提取RNA，并以健康患者的血清作陰性對照，采用實時定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒（BGI，中國深圳）檢測SFTSV-RNA載量。

1.2.2.2 N蛋白特異性IgM抗體定性檢測 采用ELISA試劑盒（中山生物技術公司，中國廣州）進行IgM抗體定性檢測。首先取稀釋后的血清樣本100μL（樣品稀釋液90μL＋血清10μL）置于酶標孔，37℃孵育40 min，然后用洗滌液洗滌6次；每孔再加入100μL酶結合物，37℃孵育40 min，然后再用洗滌液洗滌6次；每孔分別加入顯色液A與顯色液B，37℃孵育15 min，在450 nm條件下測量光密度（OD）。如果樣品的OD值大于閾值（截止值），相應的孔被認為陽性，否則為陰性。

1.2.2.3 N蛋白特異性IgM抗體滴度的檢測 采用傳統的ELISA方法對血清進行N蛋白特異性IgM抗體（＋）滴度測定。首先在96孔板中包被N蛋白100μL，4℃冰箱中過夜；然后用0.1%Triton-X的PBS洗滌液200μL洗滌5遍，在4%乳清稀釋緩沖液和5%奶粉的混合液200μL中室溫封閉1 h，然后再洗滌5遍；加入不同稀釋濃度（1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000）的樣本血清100μL在室溫條件下孵育1 h，再洗滌5遍；每孔中加入稀釋的IgM 抗體100μL在室溫條件下孵育1 h；每孔中依次加入顯色液A、B各50μL，顯色3 min，最后加入25μL終止液使反應停止。用全自動多功能酶標儀450 nm處檢測OD值，OD值大于正常健康對照兩倍的最大稀釋倍數被認為是最終IgM抗體滴度。

1.3 統計學分析 應用SPSS 22.0軟件對數據進行統計。非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗；P≤0.05為差異具有統計學意義，所有檢驗均為雙側檢驗。

2 結果

2.1 患者基本情況 本研究共納入患者30例，其中男性10例，女性20例，平均年齡55（48，68）歲，其中高熱（＞39℃）患者16例（53.3%），淋巴結大患者8例（26.7%），病情嚴重患者10例（33.3%），死亡患者5例（16.7%）。

2.2 N蛋白特異性IgM抗體滴度、SFTSV-RNA的動態變化規律 發病第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天時N蛋白特異性IgM抗體滴度分別為8 923（0，0）、22 688（0，16 000），43 407（12 000，64 000），31 764（14 000，48 000）；IgM 抗體滴度在發病14 d內逐漸升高，發病14 d后開始下降；發病第10天有15例（50.0%）患者出現IgM抗體，發病第14天有18例（60.0%）患者出現IgM抗體。發病第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天時患者的SFTSV-RNA 載 量 分 別 為16 504（0，12 609）、1 814 763（0，54 528）、1 960 334（0，2 094）、415.65（0，82）copies／mL；在發病第13天時15例（50.0%）患者SFTSV-RNA得到清除，在發病第14天時有17例（56.7%）患者SFTSV-RNA得到清除。

2.3 N蛋白特異性IgM（＋）組與IgM（－）組患者臨床特點比較 所有患者起病時均有發熱，部分患者出現腹瀉、頭痛、咳嗽、淋巴結大、神經癥狀等，嚴重者甚至出現死亡。與N蛋白特異性IgM（＋）組患者相比，IgM（－）組患者病情嚴重、出現精神癥狀者較多，且病死率高，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 SFTS患者N蛋白特異性IgM（＋）組與IgM（－）組患者的臨床特點（例）Table 1 Clinical characteristics of N protein specific IgM（＋）group and IgM（－）group（No.of cases）

2.4 N蛋白特異性IgM抗體滴度與SFTSV-RNA載量相關性 30例SFTS患者按照病情嚴重程度分為輕癥、重癥兩組；其中輕癥組患者20例，重癥組患者10例；死亡患者5例，均為重癥組患者。兩組患者在性別、年齡上比較差異無統計學意義（均P＞0.05）。輕癥組患者出院時SFTSV-RNA載量均轉為陰性；重癥組患者有2例在出院時SFTSV-RNA載量未見轉陰，且2例患者均死亡。輕癥組患者住院期間N蛋白特異性IgM抗體均為陽性，重癥組患者有3例直至出院時N蛋白特異性IgM抗體仍為陰性，其中2例患者死亡，死亡時SFTSV-RNA載量很高。發病第7～9天時輕癥組患者N蛋白特異性IgM抗體滴度高于重癥組患者，但差異無統計學意義（P＝0.08），SFTSV-RNA 載量低于重癥組患者，差異也無統計學意義（P＝0.10）；發病第10～13天時輕癥組患者N蛋白特異性IgM抗體滴度高于重癥組患者，差異有統計學意義（P＜0.05），SFTSV-RNA載量低于重癥組患者，但差異無統計學意義（P＝0.06）。見圖1。

圖1 輕癥組與重癥組患者N蛋白特異性IgM抗體滴度及SFTSV-RNA載量的比較Figure 1 Comparison of N protein specific IgM antibody titer and SFTSV-RNA load in mild and severe patients

2.5 重癥患者中死亡患者與存活患者IgM抗體和SFTSV-RNA載量特征 重癥組患者按預后分為存活組和死亡組。存活組患者與死亡組患者在發病第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天時N蛋白特異性IgM抗體滴度分別為48 000 VS 0、15 000 VS 7 200、96 000 VS 64 000、26 666 VS 12 000；存活組患者在發病第3～6天SFTSV-RNA載量為15 771 copies／mL，存活組患者與死亡組患者在發病第7～9天、第10～13天、第14～20天時SFTSV-RNA載量分別為8 093 673 VS 28 358 018、22 823 VS18 905 345、39 VS3 285 copies／mL。與存活組患者相比，死亡組患者N蛋白特異性IgM抗體滴度低于存活組患者，SFTSV-RNA載量高于存活組患者，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.6 N蛋白特異性IgM 抗體滴度、SFTSV-RNA載量與實驗室結果相關性 采集30例SFTS住院患者發病后不同時間階段（第0～2天、第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天）的血清，檢測其SFTSV-RNA載量、N蛋白特異性IgM抗體滴度、凝血功能指標、肝病酶學及心肌酶譜。檢測結果顯示N蛋白特異性IgM抗體水平與SFTSVRNA載量、凝血酶原時間（PT）、乳酸脫氫酶（LDH）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）均呈負相關（r值分別為－0.495、－0.440、－0.367、－0.280，均P＜0.05）；而與血小板（PLT）呈正相關（r＝0.335，P＝0.002）。SFTSV-RNA 載 量 與 PT、LDH、AST均呈正相關（r值分別為0.606、0.604、0.587，均 P＜0.001）；與 PLT 呈負相 關 （r＝－0.384，P＜0.001）。見圖2。

圖2 N蛋白特異性IgM抗體滴度、SFTSV-RNA載量與實驗室結果相關性Figure 2 Correlation of N protein specific IgM antibody titer，SFTSV-RNA load，and laboratory results

3 討論

抗體靶向治療是治療傳染病的一種有效可行的方法，其用于呼吸道合胞病毒和埃博拉病毒感染的治療均已取得了一定成果。近些年，已經通過誘導中和抗體獲取流感病毒疫苗［9］。目前，SFTS尚無特效療法，主要以支持治療為主，本病相關的診治研究相對較少［10］。SFTS患者預后較差，約有12.7%～20.6%患者出現死亡［11－13］，因此，急需更多研究分析SFTS特異性抗體在發病過程中的作用。

近年來，有研究［7－8］發現 SFTSV RNA 基因編碼7種蛋白質，其中有3種重要的抗原蛋白，即N蛋白、Gn和Gc糖蛋白。Gn和Gc糖蛋白由M片段編碼的前體蛋白切割產生，其主要作用是負責受體結合和膜融合以介導病毒進入宿主細胞，而N蛋白主要集中在診斷及檢測SFTS方面。

本研究發現，在急性感染階段SFTSV特異性體液應答在急性感染期主要是N蛋白特異性抗體應答，而只有少數患者具有Gn或Gc低滴度特異性抗體應答。本研究中近50%患者N蛋白特異性IgM抗體出現中位時間為發病第10天，與其他研究［14］基本一致。在裂谷熱病毒（RVFV）或托斯卡納病毒感染患者中，N蛋白是急性感染期和恢復期期間負責產生IgM 和IgG 的主要抗原［7，15－17］。

本研究還發現N蛋白特異性IgM抗體可能直接或間接地起到減輕SFTS疾病嚴重程度的作用。首先，研究發現在急性感染階段缺乏N蛋白特異性IgM抗體的患者SFTSV-RNA載量較高，且病情較為嚴重。與無N蛋白特異性IgM抗體應答的患者相比，誘導IgM抗體應答的患者疾病進展相對較輕。重要的是，N蛋白特異性IgM抗體應答的水平也與實驗室結果改變相關。隨著N蛋白特異性IgM應答的出現，SFTSV-RNA得到快速清除，患者凝血功能、肝功能、心肌功能得到恢復，且N蛋白特異性IgM抗體應答較早的患者恢復相對較快。

本研究發現輕癥患者在住院期間均出現N蛋白特異性IgM應答，且出現應答時間較早、滴度較高；而重癥患者出現N蛋白特異性IgM應答較晚、滴度較低；因此，N蛋白特異性IgM抗體滴度定量檢測有助于臨床醫生評估病毒清除率和患者臨床預后。對于無N蛋白特異性IgM抗體應答或具有低水平IgM抗體滴度的SFTS患者需要重視并給予積極有效的治療策略。

綜上所述，本研究發現SFTS患者病情嚴重程度與N蛋白特異性IgM抗體水平相關，且IgM抗體產生可能是病情得到較快緩解的原因之一。本研究發現高滴度N蛋白特異性IgM抗體的出現有利于改善SFTS疾病的病情，有利于SFTSV的清除，并有助于凝血功能、肝功能、心肌功能的恢復。SFTS患者可以常規進行N蛋白特異性IgM抗體滴度的檢測，可能有助于預測SFTS患者的臨床預后。此外，N蛋白特異性IgM抗體可能可作為治療重癥SFTS患者的方法，從而降低病死率。本文的局限性主要是本研究為單中心研究，且納入患者人數少；但N蛋白特異性IgM抗體是否可以預測患者死亡，可以通過擴大樣本量進行進一步研究。