利用生物信息學探索介導鮑曼不動桿菌血流感染的相關蛋白

馮文艷，張扣興

（中山大學附屬第三醫院，廣東 廣州 510530）

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，AB）為非發酵革蘭陰性桿菌，有莢膜和菌毛，無鞭毛，定植遠多于感染，屬于條件致病菌［1］，主要引起呼吸道感染，也可引發敗血癥、泌尿系統感染、繼發性腦膜炎等，是醫院感染的重要病原菌，其中ST92型（此為Bartual方案分型，與法國巴斯德研究所方案中ST2型對應）是世界上分布最廣的ST型［2］。近年來，AB的感染不斷增多，且其耐藥性日益嚴重，多重耐藥鮑曼不動桿菌 （MDR-AB）、泛耐藥鮑曼不動桿菌 （PDR-AB）、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（CRAB）等廣泛傳播，給治療帶來很大挑戰。臨床觀察及臨床數據調查顯示，AB感染在重癥監護病房（ICU）普遍存在［3－4］，與單純的肺部感染相比，血流感染治療極為困難，患者病死率高、預后差，且與耐藥性無明確相關性，耐藥性高的AB若定植于痰，不發生血流感染，則患者預后良好［5］。AB入血的機制尚不清楚，目前，許多研究對AB血流感染的危險因素進行分析，發現深靜脈置管、機械通氣、粒細胞缺乏等是主要危險因素［6－8］，但AB多發生于ICU或術后患者，大多身體狀況較差、免疫力低下，這些危險因素在臨床治療中不可避免，不適當的初始治療是重要危險因素，早診斷、早治療是關鍵［9－10］。臨床觀察發現，即便是同一多位點序列分型（MLST）的AB感染，進行同樣的臨床操作（深靜脈置管、機械通氣等），部分患者僅限于肺部感染，而另一部分患者卻更易發生血流感染，推測影響AB血流感染的因素不僅有有創操作、患者自身免疫等外部及患者因素，菌株的生物學特性差異也是重要原因，具體機制尚不清楚。推測找到AB自身侵襲宿主的可能關鍵蛋白，有助于防治AB血流感染。本研究主要采用生物信息學方法對已報道的AB基因組學進行分析，探索介導AB血流感染的相關蛋白。

1 資料與方法

1.1 菌株資料收集 在AB基因、蛋白數據庫（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genome／genomes／403？）中對目標菌株進行檢索，檢索策略為：（1）MLST相同，但是分離部位不同的AB菌株；（2）考慮到AB存在進化，因此菌株分離年份必須相同；（3）考慮AB的地區分布差異，所檢索的AB菌株均從中國醫院分離；（4）菌株存在完整的基因組學數據，將同一MLST、不同分離部位的AB分為同一組別。

1.2 分析方法 利用在線工具軟件（http：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），對檢索到的相同ST分型AB基因組學數據、蛋白數據進行分析，由于蛋白執行相應的功能，直接介導了AB的不同生物學特性，因此，重點選擇蛋白數據進行分析，找出僅存于血流感染AB的特有蛋白。隨后，在 Uniprot（http：／／www.uniprot.org／）、UCSC（http：／／genome.ucsc.edu／）、KEGG （http：／／www.kegg.jp／kegg／pathway.html）等數據庫對篩選出的特異蛋白進行功能鑒定、聚類分析。

2 結果

2.1 菌株一般信息 在設定的檢索條件下，共檢索10株AB，其中ST92型4株（分離自血、痰各2株）、ST137型4株（分離自血、痰各2株）、ST365型2株（分離自血、痰各1株）。將10株AB按MLST分為3組，見表1。

表1 10株納入研究的AB信息Table 1 Information of 10 strains of AB that were included in this study

2.2 蛋白差異分析 對不同組別AB基因、蛋白數據庫進行數據分析，結果顯示，部分蛋白僅存在于血流感染AB中，不存在于分離自痰的AB中，其中ST92、ST137、ST365型血流感染AB中分別存在20、4、22個特有蛋白。見圖1。

圖1 3組MLST AB的差異蛋白數據分析結果Figure 1 Data analysis of differential protein of 3 groups of MLST AB

針對僅存在于血流感染AB的特有蛋白進行功能注釋、分析，結果發現，存在于ST92型血流感染AB中的20個特有蛋白，其生物學過程主要集中于細菌代謝、DNA合成、DNA損傷及修復、轉錄翻譯、基因轉座、以及噬菌體相關蛋白等通路上；存在于ST137型血流感染AB中的4個特有蛋白，其生物學過程主要集中于細菌毒力、細菌代謝、基因轉座等通路上；存在于ST365型血流感染AB中的22個特有蛋白，其生物學過程主要集中于細菌毒力與侵襲力、細菌代謝、DNA合成、DNA損傷及修復、轉錄翻譯、基因轉座、以及噬菌體相關蛋白等通路上，見表2。

表2 不同MLST血流感染AB中的特有蛋白及其生物學功能Table 2 Specific protein in AB causing BSI of different types of MLST and their biological functions

3 討論

AB在大自然環境中廣泛分布，尤其在醫院環境中廣泛定植，是引發醫院內獲得性感染的重要條件致病菌。研究［11］認為，AB在痰培養中常見，血流感染中少見，但近年隨著住院患者醫療操作的逐漸增多，以及對AB的認識及重視程度進一步加深，血流感染中AB檢出率越來越高。臨床上，患者一旦發生血流感染，病死率極高，預后差。目前，針對AB血流感染的相關研究也越來越多，主要集中于對導致AB血流感染的危險因素分析。

臨床工作中發現，長期臥床的ICU患者，在危險因素相同情況下，有些患者僅限于肺部感染，有些患者易發生血流感染，推測影響AB血流感染的相關因素可能還有AB的生物學特性差異，但具體機制尚不清楚。

課題組前期的綜述中將AB的致病力主要分為以下幾類：（1）對患者的侵襲因素；（2）適應營養物質匱乏等惡劣生存環境的能力；（3）抵抗損傷的能力；（4）外在影響因素［12］。本研究對AB基因數據庫進行檢索，找到若干株MLST相同，但是分離部位不同的AB菌株。隨后，對檢索到的相同ST分型AB基因組學數據、蛋白數據進行分析，探討僅存在于血流感染AB中的特有蛋白。ST92、ST137、ST365三種不同MLST血流感染AB特有蛋白的功能主要集中在細菌毒力與侵襲力、細菌代謝、DNA合成、DNA損傷及修復、轉錄翻譯、基因轉座、以及噬菌體相關蛋白等通路上，這些蛋白的功能可歸于上述的致病力分類中。

在細菌代謝通路中，存在于ST92型血流感染的AB中的LysM domain-containing protein可正向調控病原菌中鐵離子代謝，以促進病原菌的生長［13－14］，存在于ST137、ST365型血流感染的AB中的alcohol dehydrogenase可介導乙醇代謝，并增強AB的致病力［15］；在DNA損傷修復通路中，存在于ST92型血流感染AB中的recombinase RecA、存在于365型血流感染AB中的tyrosine recombinase等重組酶相關蛋白，可以修復損傷的DNA，避免氧化應激對AB產生的致命損傷［16］；存在于ST92型、ST365型血流感染 AB中的IS5／IS1182 family transposase、存在于ST137型血流感染AB中的Tn3 family transposase等基因轉座酶，可介導耐藥基因在AB中的轉移，從而導致治療抵抗［17］。上述通路中的相關蛋白，均能增強AB在惡劣環境下的生存能力及抵抗損傷的能力。

外膜蛋白A不僅可介導AB黏附并侵襲真核宿主細胞，還可導致宿主細胞死亡并引起免疫刺激，在AB的侵襲過程中扮演重要的角色［18－20］。研究發現，血流感染ST365型AB中外膜蛋白組裝因子outer membrane protein assembly factor BamB 能正向促進外膜蛋白的組裝與表達，增強AB的侵襲性并介導其入血。同時，存在于ST92型血流感染AB中的轉錄 起 始 因 子 sigma-70 family RNA polymerase sigma factor、存在于ST365型血流感染AB中的翻譯延長因子translation elongation factor Tu及存在于ST137型血流感染AB中的分泌相關蛋白type I secretion protein可能也參與了AB侵襲相關蛋白，如外膜蛋白A的轉錄、翻譯以及分泌過程，進而促進了AB侵襲過程。

噬菌體是一種普遍存在的，能夠感染宿主菌并導致其裂解的一類病毒生物體，由于其專一性高、受抗菌藥物耐藥性影響小，臨床上可用于細菌感染性疾病的治療［21］。然而研究發現，在ST92型、ST365型血流感染AB的特有蛋白中存在一類噬菌體相關蛋白，此類噬菌體相關蛋白如何影響AB的致病力及侵襲力仍需進一步的試驗研究。

綜上所述，本研究發現在血流感染AB中存在一類特有的細菌致病力相關蛋白、噬菌體相關蛋白，在相同MLST的AB中，由于細菌群體中的個體差異，表達此類特有蛋白的AB，能在臨床治療的情況下存活，且存在高侵襲力的生物學特性，進而介導了血流感染的發生。本研究的創新性在于首次提出探索AB菌株入血的特異危險因子，以期早期預判其入血的可能性，早診斷、早治療，對改善AB感染患者的預后有重大意義，但本研究也有局限性，由于數據庫篩選樣本難度大，耗時長，數據庫樣本量少，且尚未完成實驗驗證，只是提出初步設想。數據庫的前期研究為后期實驗驗證提供了指導方向，也為廣大研究者提供了新的思路，目前課題組正收集多中心的樣本及資料，檢測血流感染和非血流感染AB相關的特異蛋白，研究此類特殊蛋白，闡明其介導AB入血的具體機制，為臨床上AB血流感染的預判、治療提供幫助。