心痛寧加味方對蒽環類藥物表柔比星誘導小鼠急性心肌損害的保護作用

王巧琳，段春燕，陸 明，胡 蘭，林 燕

（新疆醫科大學附屬中醫醫院，烏魯木齊 830000）

表柔比星是臨床上常用的蒽環類化療藥物之一，其主要用于血液腫瘤與實體腫瘤的化療治療中，但在臨床應用過程中，表柔比星誘導的心臟毒性作用限制其應用劑量，進而影響表柔比星的效果與安全性[1]。相關調查研究顯示，心痛寧加味方在臨床中具有良好的心肌保護作用，其還可對蒽環類藥物誘導心臟功能的損害具有一定保護與遏制作用，但對其實際應用的安全性以及應用劑量仍存在一定的爭議[2-3]。本研究探討心痛寧加味方對表柔比星誘導小鼠急性心肌損害的保護作用。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取雌性健康SD小鼠60只，平均體質量為（280±25）g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，合格證編號為SCXK（2014-0004），選取后飼養于25℃、45%濕度的環境中備用。采用隨機數字表法將所有小鼠分為6組，分別為對照組、表柔比星模型組、表柔比星聯合心痛寧加味方高劑量組、中劑量組、低劑量組、丹參組（表柔比星+丹參），10只/組。

1.2 研究方法 對照組小鼠選擇雙側腹腔分別注射生理鹽水，5 mL/kg，間隔30 min注射，每隔1日注射1次，7日內共注射4次；模型組則為腹腔內注射表柔比星與生理鹽水，表柔比星4.5 mg/kg，每隔1日注射1次，7日內共注射4次，注射表柔比星前30 min選擇另一區域向腹腔內注射生理鹽水，5 mL/kg；丹參組向腹腔內注射表柔比星與丹參片制備的溶液，表柔比星劑量為5 mL/kg，丹參片劑量為10 mg/kg；其他3組均為注射表柔比星與心痛寧加味方溶液，其中表柔比星劑量為4.5 mg/kg，低劑量組于表柔比星注射前30 min在另一區域內腹腔注射心痛寧加味方溶液，45 mg/kg，中劑量組則為67.5 mg/kg，高劑量組則為90 mg/kg。

1.3 觀察指標 末次給藥后24 h采血并處死大鼠，采集標本進行檢驗，BNP、h-FABP 、NO 、SOD活性、cTnI檢測試劑盒由奶精建成生物工程研究所提供，Tunel試劑盒由博士德提供，采用速率法測量血漿BNP含量，采用膠乳增強免疫比濁法定量分析cTnI水平，WST-1法測量SOD活性，TBA法測定h-FABP 、NO含量。取小鼠左室心肌應用多聚甲醛固定后進行HE染色，并在光學顯微鏡下觀察心肌組織損傷的形態學變化，并以病例評分法對心肌病變程度進行半定量分析。Tunel法檢測小鼠心肌細胞凋亡情況，選擇左室心肌應用多聚甲醛進行固定并應用Tunel進行檢測，計算凋亡指數為凋亡細胞數占總細胞數的百分率。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行不同分組表達量分析。計量資料以均數±標準差（± s ）表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中BNP、cTnI、h-FABP、SOD及NO含量比較 見表1。

2.2 各組小鼠心肌損害病理表現分析 通過對HE染色病理切片觀察發現，對照組小鼠心肌切片鏡下心肌細胞形態基本正常，部分心肌細胞間隙增寬，可見少量細胞空泡變性及間質少量纖維組織增生；模型組鏡下見部分心肌細胞空泡變性，部分細胞間隙增寬，部分細胞溶解、壞死，并見纖維組織增生；高劑量組鏡下見部分心肌細胞空泡變性及間隙增寬，部分間質內脂肪、纖維組織增生；中劑量組鏡下見部分心肌細胞空泡變性及間隙增寬，少部分心肌細胞溶解、壞死，部分間質可見少量纖維組織增生及少量炎細胞浸潤；低劑量組鏡下見部分心肌細胞間隙增寬，少量心肌細胞空泡變性，部分間質少量纖維組織增生。

表1 各組大鼠血清中BNP、cTnI、h-FABP、SOD及NO含量比較（± s ，n = 10）

表1 各組大鼠血清中BNP、cTnI、h-FABP、SOD及NO含量比較（± s ，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05，△P＜0.01

組 別 BNP/（pg/mL） cTn-I/（pg/mL） hFABP/（ng/mL） SOD/（U/mL） NO/（μmol/L）對照組 258.708±72.388 484.781±62.726 1.379±0.088 193.222±25.080 0.432±0.066模型組 543.046±80.607△ 727.432±26.747△ 1.786±0.010# 88.147±8.280# 0.802±0.156#表柔比星+丹參組 313.831±8.911# 550.681±11.619△ 1.406±0.077# 141.035±4.621# 0.602±0.076#表柔比星+高劑量組 289.352±38.281# 579.497±13.274△ 1.432±0.017# 117.529±12.960# 0.551±0.044#表柔比星+中劑量組 372.755±41.583△ 653.275±48.158△ 1.726±0.150# 111.736±26.719# 0.649±0.080#表柔比星+低劑量組 375.469±22.706△ 699.871±12.313△ 1.747±0.143# 90.818±16.053# 0.702±0.043#

2.3 各組大鼠心肌細胞病理評分及凋亡指數情況比較 見表2。

表2 各組大鼠心肌細胞病理評分及凋亡指數情況比較（± s ，n = 10）

表2 各組大鼠心肌細胞病理評分及凋亡指數情況比較（± s ，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.001，△P＜0.01

組 別 病理評分/分 凋亡指數/%對照組 0 1.52±0.74模型組 2.71±0.25# 66.54±3.82##表柔比星+低劑量組 1.91±0.19# 35.33±1.85△表柔比星+中劑量組 1.70±0.24# 20.59±2.35△表柔比星+高劑量組 1.19±0.21# 16.47±1.62#表柔比星+丹參組 1.20±0.18# 16.52±1.25#

2.4 心痛寧加味方激活PI3K/AKT/mTOR信號通路中蛋白的表達 見圖1，圖2，圖3。

圖1 PI3K/AKT/mTOR信號通路中mTOR及其磷酸化和AKT及其磷酸化蛋白表達變化

圖2 AKT與mTOR蛋白相對于actin的表達量分析

A.對照組；B.模型組；C.表柔比星+低劑量組；D.表柔比星+中劑量組；E.表柔比星+高劑量組；F.表柔比星+丹參組

圖3 p-AKT、p-mTOR分別相對于AKT、mTOR的表達量分析

2.5 心痛寧加味方激活AKT/mTOR信號通路中mRNA的表達 見圖4。

圖4 心痛寧加味方激活AKT/mTOR信號通路中mRNA的表達

3 討論

表柔比星等蒽環類藥物誘發的心肌損害是其常見的藥物不良反應，其心肌損傷機制可能與氧化應激反應、細胞凋亡等密切相關，其中氧自由基所誘發的細胞凋亡是心功能損害的主要機制，試驗研究[4-5]顯示即使心肌細胞暴露于極低濃度的表柔比星中，同樣可導致細胞凋亡的加劇。目前心肌組織活檢是評估蒽環類藥物心臟損害的金標準[6]，而在動物實驗中通過表柔比星的心肌損害，可見其心腔的明顯增大以及心室壁變薄，并有一定的風險誘發心包積液、擴張型心肌病等，隨著病情的加重可出現細胞間隙明顯增寬、炎癥細胞浸潤等現象[7-8]。

本研究結果表明，各組BNP、h-FABP 、NO、SOD活性、cTnI指標比較存在顯著差異，模型組心肌細胞病例評分明顯高于低、中、高劑量組，并且各組心肌細胞凋亡指數比較存在顯著差異，以模型組心肌損害、凋亡效果最為嚴重，除對照組外以高劑量組心肌損害、凋亡最輕。心痛寧加味方是沈寶藩教授根據“痰瘀同治”的治療原則，在心痛寧方基礎上配伍新疆民族藥中化痰通絡之品組方。沈寶藩教授認為，腫瘤病雖為本虛標實之證，但痰濕凝聚是導致其發生的重要方面，在腫瘤的形成過程中，痰濕乃因血瘀導致津液運行失常而成，一旦形成則痰瘀互結，日久成積，從而形成了血瘀津停，痰瘀互結的腫瘤病機的基礎[9-10]。方中瓜蔞、薤白利氣化痰，散結寬胸，溫陽止痛；佐以當歸、丹參、紅花、川芎活血化瘀，行氣止痛；配合以厚樸、桔?？嘟敌灵_，行氣散結[11]；伍以新疆民族藥新塔花、阿里紅、沙棘、豆蔻，氣血雙調。諸藥配合，瘀祛痰消，脈絡通暢，疼痛得解。通過進一步回顧分析認為，丹參作為唇形科多年生草本植物在藥典中具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩等功效，成分中主要有脂溶性的多種丹參酮類及水溶性的原兒茶酚醛和兒茶酚的衍生物[12-14]，具有擴張冠脈、增加血流量、耐缺氧、增強心肌收縮力、減慢心率的功效，從而促進組織修復，改善心臟功能，應用于小鼠中同樣可遏制蒽環類藥物心臟損害進程，為小鼠心肌提供保護作用[15]。

綜上所述，心痛寧加味方對表柔比星誘導的小鼠心肌損害具有良好的保護作用，可有效降低氧自由基的產生，并通過降低脂質過氧化物含量達到改善心肌損害及調節凋亡的目的。但本研究仍存在一定的缺點與不足，如樣本容量過小可能導致結果客觀性不足，這有待于進一步臨床研究證實。