川芎嗪聯合紫衫醇對HL-60細胞凋亡的影響

李續博，姜廣宇，董 航*

（1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040；2.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154002）

急性髓細胞白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一種惡性血液腫瘤[1-2]，急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓細胞白血病（AML）的一種亞型，以其獨特的染色體異常，即t（15；17）產生融合基因PML-RARα及其編碼的蛋白為主要特征[3-5]。使用全反式維甲酸（ATRA）、三氧化二砷（ATO）、化療藥物，或與化療藥物兼用是治療APL的主要策略[6]。雖然有可能在低風險的APL治療中獲得成功，但對高危APL治療成功案例尚未見報道。因此，需要開發治療高風險APL的治療藥物。

川芎嗪又名天然四甲基吡嗪，是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的生物堿單體，是中藥川芎的主要有效成分。近年來研究發現，川芎嗪能有效抑制腫瘤細胞的侵襲及轉移，促進腫瘤細胞凋亡的作用。紫杉醇是一種微管穩定劑，用作治療卵巢癌、乳腺癌和肺癌，肉瘤、淋巴瘤和白血病的化療藥物[8]。紫杉醇因其具有很高的協同作用，所以常與其他藥物聯合使用，可以克服單獨使用時產生的耐藥性[9]。所以本研究川芎嗪與紫杉醇聯用對急性早幼粒細胞的影響，探索治療急性早幼粒細胞白血病的新策略。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 HL-60細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），紫衫醇（赫澎生物上海科技有限公司20170321），川芎嗪（赫澎生物上海科技有限公司20170925）。川芎嗪和紫衫醇在DMSO中溶解并在濃縮的蒸餾水中進行濃縮至10 mM和1 M，過濾。

1.2 細胞培養 在這項研究中我們使用HL-60細胞系作為人類急性早幼粒細胞白血病模型。HL-60細胞在含有1%的谷氨酰胺，1%青霉素/鏈霉素，10%熱滅活胎牛血清（FBS）RPMI-1640培養基中培養，在標準細胞培養箱中保持37 ℃，5%二氧化碳和95%相對濕度。

1.3 細胞毒性試驗 紫杉醇和川芎嗪對HL-60細胞的毒性作用使用細胞增殖劑WST-1（羅氏）測定。細胞接種于96孔板，細胞濃度106個/mL。實驗細胞取處于對數生長期，川芎嗪（10 μM～1 nM）和紫杉醇（10 mM～1 μM）處理細胞24 h，48 h，72 h。未經處理的細胞作為對照組。活細胞形成的形成甲瓚染料使用酶標儀波長450 nm和620 nm檢測。

1.4 細胞凋亡測定 紫杉醇與川芎嗪聯合用藥對HL-60細胞凋亡的影響，使用AnnexinV EGFP細胞凋亡試劑盒和JC-1分析試劑盒。HL-60細胞1×106個/mL接種于6孔板中，紫杉醇與川芎嗪聯合用藥（4 μM川芎嗪和34 nM紫杉醇）處理細胞24 h、48 h 和72 h。結果通過對熒光顯微鏡Olympus BX51對200個細胞進行計數處理。

1.5 實時定量 PCR分析 測定mRNA表達的變化，聯合藥物處理細胞48 h內聯合劑量（4 μM川芎嗪和34 nM紫杉醇）。用高純度RNA分離試劑盒提取總RNA。聯合藥物處理和未經藥物處理的細胞進行細胞周期、凋亡與若干信號通路相關基因cDNA合成。基因的表達是通過LightCycler 480實時熒光定量RT-PCR研究儀器II檢測 ，2-△△CT法定量比較樣本對內參的循環閾值的差異。

1.6 統計學分析 IC50值和川芎嗪聯合紫衫醇對HL-60細胞劑量使用Calcusyn 2軟件進行非線性回歸曲線計算。real-time RTPCR變化使用在線軟件統計分析，以P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞毒性 IC50劑量，紫杉醇和川芎嗪72 h劑量分別為4.8 nM（R2= 0.896 1，P＜0.05）和398.7 m（R2=0.948 3，P＜0.05）（圖1、2），紫杉醇與川芎嗪最佳聯合劑量為34 nM和4 μM（R2= 0.975 74，P＜0.05）（圖3、4）。

2.2 川芎嗪聯合紫杉醇對細胞凋亡的影響 紫杉醇和川芎嗪對HL-60細胞凋亡的影響，Annexin V法，與對照組相比，聯合用藥 24 h，48 h，72 h分別為對照組的1.14倍，12.7倍，8.2倍（圖5）。JC-1法，與對照組相比，24 h，48 h和72 h，聯合劑量組細胞凋亡分別為對照組的2.5倍，9.4倍，114.3倍（圖6）。

圖1 紫杉醇對HL-60細胞的影響

圖3 川芎嗪聯合紫杉醇對HL-60細胞的影響

圖4 川芎嗪聯合紫杉醇對HL-60細胞的影響

圖5 紫杉醇對HL-60細胞凋亡的影響

2.3 川芎嗪聯合紫杉醇對基因表達的影響 紫杉醇和川芎嗪的組合對HL-60細胞中24個基因的表達發生了顯著的變化（P＜0.05）。其中22個基因表達下調，2個基因表達上降。見表1。

3 討論

APL是AML的一種亞型，臨床早期由于彌散性血管內凝血（DIC）引起出血致死率非常高，使用全反式維甲酸降解PML/RARα融合蛋白，ATO或與化療藥物聯合應用是APL的主要治療策略[7]。雖然對低危患者的治療可以通過全反維甲酸- ATO聯合治療可以治愈，但對于高風險APL的治療成功案例尚未有報道。因此，開發治療高危APL藥物是目前的迫切需要。

圖6 川芎嗪對HL-60細胞凋亡的影響

紫杉醇是一種微管穩定劑，用作治療卵巢癌、乳腺癌和肺癌，肉瘤、淋巴瘤和白血病的化療藥物[8]。紫杉醇因其具有很高的協同作用，所以常與其他藥物聯合使用，可以克服單獨使用時產生的耐藥性[9]。在臨床前細胞實驗研究表明：紫杉醇與ATRA聯合用藥具有誘導急性髓白血病的協同作用[10]。單獨紫杉醇誘導HL-60細胞凋亡，0.1 μm和1 μm 24 h內誘導HL-60細胞凋亡分別為17.8倍和 16.5倍[11]。

川芎嗪又名天然四甲基吡嗪，是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的生物堿單體，是中藥川芎的主要有效成分。近年來研究發現，川芎嗪能有效抑制腫瘤細胞的侵襲及轉移，促進腫瘤細胞凋亡，這對白血病的髓外轉移和復發具有積極的意義[12-15]。

細胞增殖與分化與正常造血系統密切相關。在細胞分裂過程中，兩個細胞中的一個維持干細胞的特性，另一種則維持干細胞的特性。單核細胞和淋巴細胞的細胞系獲得的需求增加[16]。增生增加白血病的遺傳損傷的概率，損傷的DNA反應通路有助于遺傳變異，導致白血病的加速形成[17]。因此，細胞周期調控因子如細胞周期調節改變，細胞周期蛋白依賴激酶（CDK），控制點和有絲分裂激酶激酶導致不規則增生與分化的相互作用髓系惡性腫瘤的途徑。例如，CCND2頻繁表達高水平的B細胞惡性腫瘤如BLL，LPL[18]。此外，CDK6，具有造血功能的獨特作用，主要表達于造血細胞類型。這個小鼠胸腺萎縮和CDK6損失導致紅血減少細胞，粒細胞，巨噬細胞，中性粒細胞和血小板，以及因為在CDK6小鼠淋巴細胞G1晚期進展[19-21]。

表1 川芎嗪聯合紫杉醇對基因表達的影響

在這項研究中，紫杉醇聯合川芎嗪促進HL-60細胞細胞周期蛋白（CCNB1，CCNB2，CCNC，CCND1，CCND2，CCNE1，CCNF，CCNG1、CCNG2）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDC16、CDC20，CDC25A，CDC34、CDK1、CDK2、CDK4 、CDK5R1、CDK7，CDK8）表達下降。此外，細胞周期蛋白依賴性抑制激酶CDKN1B表達增加，DNA損傷應答基因ATR 、CHEK1、CHEK2和細胞周期相關因子E2F4表達量降低。

在我們的研究中，川芎嗪在低劑量下具有協同作用。4 μM川芎嗪與34 nM紫杉醇聯合用藥誘導HL-60細胞凋亡。因此，我們建議將紫杉醇和川芎嗪兩者結合起來的方法作為開發治療APL的一種新的治療策略。