鈷60輻照滅菌參景片的適用性研究

后 宗，貢濟宇

（長春中醫藥大學，長春 130117）

參景片為中藥復方制劑，其含有人參、紅景天、蜂王漿凍干粉等多種原料，對人體具有緩解疲勞的作用[1-6]。其中10-羥基-α-癸烯酸是蜂王漿凍干粉的主要有效成分，也是本品的質量控制指標之一。課題組在制劑的工藝研究過程中，采用鈷60輻照方式對其進行滅菌。此滅菌法作為輻射滅菌中的一種，是近幾十年來較為新型的技術，具有滅菌徹底、常溫操作、無二次污染、節約能源等優點，廣泛應用于食品、器械及醫藥領域[7-8]，但同時也可能引起制劑中的主要化學成分發生變化。現為研究鈷60滅菌對本制劑的適用性，課題組在現有的基礎上，通過HPLC法對制劑中有效成分10-HAD的含量[9-11]及方法系統適應性進行考察，分析10-HAD鈷60輻照前后含量的變化情況，結合滅菌效果對鈷60輻照的適用性作以評價。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀：紫外檢測器（美國安捷倫科技有限公司）；ME204型萬分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；MS205W型十萬分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；KH-500B型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；ZP-7旋轉式壓片機（上海天駒制藥機械有限公司）。

1.2 試藥試劑 10-羥基-α-癸烯酸標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110812-201507，含量為99.2%）；甲醇（色譜純：CHROMADEX；分析純：天津市福晨化學試劑廠）；磷酸（分析純：天津市福晨化學試劑廠）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 輻照處理 鈷源裝載量6.6×105，輻照劑量9 kGy，輻照時間為32 h。

2.2 色譜條件 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50:50）；流速1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm。

2.3 溶液制備

2.3.1 標準品溶液制備 取10-HAD標準品約10 mg，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的標準品儲備液，分別精密量取標準品儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、2.4 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為4、8、12、16、24、48 μg/mL的標準品系列溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 取本品20片，研細，取樣品約1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲提取15 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密吸取續濾液5 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 陰性對照溶液制備 取去除蜂王漿凍干粉的配方，按制劑的制備工藝，依法制備蜂王凍干粉陰性樣品。

2.4 輻照前后樣品性狀比較 按2.1項下輻照處理方法進行滅菌，取樣對比樣品輻照前后性的變化，結果表明，樣品鈷60滅菌前后性狀無明顯改變。

2.5 輻照滅菌效果 按2.1項下輻照處理方法進行滅菌，取樣對比樣品輻照前后微生物指標變化。結果輻照前霉菌數嚴重超標，菌落總數偏高，其他指標在合格范圍內；輻照后所測指標均合格。表明樣品鈷60滅菌效果理想。見表1。

表1 輻照前后微生物指標變化

2.6 方法學考察

2.6.1 檢測波長和專屬性的考察

2.6.1.1 波長選擇 按2.3項下各法制備10-HAD標準品溶液、供試品溶液及蜂王漿凍干粉陰性供試品溶液。取上述溶液及空白試劑，采用紫外-可見分光光度法，在190～800 nm波長下進行掃描，結果得10-HAD在210 nm處有最大吸收。

2.6.1.2 專屬性考察 將2.6.1.1項下標準品溶液、供試品溶液、蜂王漿凍干粉陰性供試品溶液分別注入高效液相色譜儀中，按2.2項下色譜條件進行分析，結果表明蜂王漿凍干粉陰性溶液對供試品溶液中10-HAD的含量測定無干擾。

2.6.2 線性關系考察 按2.3.1項下方法制備標準品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行分析，以10-HAD峰面積積分值為縱坐標，標準品進樣濃度（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為：Y =40.894 X-23.935，r = 0.999 9。表明10-HAD的測定量在0.04～0.52 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.6.3 精密度考察 按2.3項下方法制備標準品溶液（24 μg/mL）及供試品溶液，按2.2項下色譜條件連續測定6次，記錄峰面積積分值，得標準品溶液及供試品溶液中10-HAD峰面積積分值的RSD分別為0.03%、0.04%，結果表明儀器的精密度良好。

2.6.4 重復性試驗 取同一樣品（批號20170501）6份各1 g，精密稱定，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行分析，得10-HAD含量分別為 0.96、0.97、0.97、0.96、0.95、0.96 g/100 g，平均含量為0.96 g/100 g ，RSD為1.4%，小于3%，符合要求，表明該方法對本品中10-HAD測定結果的重復性良好。

2.6.5 回收率考察 取已知含量的樣品（批號：20170501；含量為0.96 g/100 g）9份各0.5 g ，精密稱定，將9份樣品分為3組， 每組分別加入按2.3.1項下制備的標準品溶液，使加入量與所取供試品中10-HAD 的量之比約為0.5:1、1:1、1:1.5，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進行分析，計算回收率，得10-HAD的平均回收率為97.5%，RSD為1.1%，小于3%，符合要求。見表2。

表2 回收率測定結果

2.6.6 穩定性考察 按2.3項下方法制備標準品溶液（24 μg/mL）及供試品溶液，按2.2項下色譜條件進行分析（室溫條件下放置），分別于0、4、8、16、24、48 h依次進行測定，記錄峰面積積分值，得標準品溶液及供試品溶液中10-HAD峰面積積分值的RSD分別為0.8%、0.7%，結果表明標準品溶液和供試品溶液在（0～48）h內穩定。

2.7 3 批樣品測定 取3批（批號：20170501；20170502；20170503）鈷60輻照前后的樣品各1 g，精密稱定，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進行分析，結果3批樣品中10-HAD含量在輻照前后基本一致，無明顯變化。見表3。

3 小結

制劑中蜂王漿凍干粉是在低溫真空條件下干燥而成的，避免了普通高溫干燥造成的成分氧化、活性破壞等因素。課題組在研究過程中，對濕熱滅菌法、干熱滅菌法、鈷60滅菌法、微波滅菌法等多個滅菌方法進行了分析篩選。其中濕熱滅菌法及干熱滅菌法都屬于熱力滅菌方法，濕熱滅菌后對樣品的性狀產生了較大的影響。干熱滅菌溫度更高、時間更長，對成分含量的影響較大。微波輻射滅菌對物料內外同時加熱，內部溫度高、熱量從內到外傳導，加熱時間短，雖可在較低溫度下進行，但為保證10-HAD含量不受影響，最終選用常溫滅菌下的鈷60輻照滅菌。

輻照滅菌在食品和藥品生產中已經成為不可或缺的工序。美國已將其寫入藥典。并在英國和歐盟等國家中廣泛使用。安全性評價方面，中藥輻照一般使用密封型鈷60輻射裝置，被照物在滅菌時不接觸放射性元素，不沾染放射性物質[7,12]。1980年10月，“輻照食品聯合專家委員會”歸納分析各國30多年安全性研究結果，確認“為儲存目的，任何食物受到總平均劑量10 kGy以下的輻照（γ射線和10 MeV以下電子束），不再需要進行毒物學方面的檢測，也沒有特殊營養和微生物問題”[8,13]。因此，本品在9 kGy下鈷60輻照后的安全性是有保障的。

含量測定方法的研究中，課題組對該方法的供試品制備過程，專屬性，準確度，色譜條件，線性，精密度，溶液穩定性，耐用性等進行了系統的考察[14-16]。最后通過三批樣品進行驗證，結果表明該方法檢測結果靈敏度高，穩定性好，可重復操作。

綜上，研究通過微生物的滅菌效果和10-HAD含量變化對鈷60輻照滅菌進行評價，并對10-HAD的含量測定方法做了系統適應性考察[17]，結果顯示鈷60輻照滅菌效果明顯，能達到相關標準要求，且10-HAD的含量在鈷60輻照前后基本一致，未發生顯著性變化，為本制劑鈷60輻照（輻照劑量9kGy）滅菌的適用性提供了依據。另外，課題組正在對制劑中其他指標成分鈷60輻照前后的含量變化進行研究，以更好的評價本制劑鈷60輻照滅菌的適用性。