基于DART-MS技術(shù)的人參皂苷結(jié)構(gòu)分析

閆福源，許 寧，王任晶，崔長(zhǎng)升，齊 濱，劉淑瑩，王 洋，劉 莉

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

最早的直接離子化方式電噴霧解吸電離（DESI）由Cooks等[1]在 2004 年提出，實(shí)現(xiàn)了常壓下對(duì)固體表面痕量待測(cè)物的直接分析，該技術(shù)還應(yīng)用于藥品中非法添加物分析[2]和天然植物產(chǎn)物分析[3]等。在所有的直接質(zhì)譜分析中，最早實(shí)現(xiàn)商品化的直接電離源是實(shí)時(shí)直接分析（DART）[4]。2005年，Cody等[5]報(bào)道了實(shí)時(shí)直接分析，這是繼電噴霧電離源成功解決了傳統(tǒng)質(zhì)譜電離源無(wú)法分析生物大分子這一難題后，又一具有革命性的質(zhì)譜離子化技術(shù)。與DESI相比，因無(wú)需化學(xué)溶劑輔助離子化，對(duì)樣品和環(huán)境均無(wú)污染，離子化效率更高，操作更簡(jiǎn)便，也是近年分析技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一，在法庭科學(xué)中微量物證和毒物毒品檢驗(yàn)[6-7]、煙草及煙草制品中的煙堿檢測(cè)[8]、包裝材料中禁限用成分檢測(cè)[9]和谷物中霉菌毒素分析[10]等方面均有應(yīng)用。

人參皂苷（ginsenosides）是由人參皂苷元與糖相連構(gòu)成的糖氧苷類(lèi)化合物，為人參、西洋參和三七等五加科人參屬植物中主要有效成分。通常，人參皂苷按皂苷元的結(jié)構(gòu)不同主要分為三大類(lèi)，即達(dá)瑪烷型、齊墩果烷型和奧克梯隆型三類(lèi)。達(dá)瑪烷型人參皂苷包括人參二醇型和人參三醇型兩類(lèi)。奧克梯隆型目前為止在人參及三七中未發(fā)現(xiàn)，是區(qū)別人參和西洋參的特征成分。近年來(lái)，從人參中分離鑒定了50余種人參皂苷，從西洋參中分離鑒定了60余種人參皂苷，從三七中分離鑒定了20余種人參皂苷。本文通過(guò)DART-MS技術(shù)建立了人參皂苷快速定性檢測(cè)方法，該方法具有通用性強(qiáng)、耐用性好、檢測(cè)靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（6520 Q-TOF，美國(guó)安捷倫公司），實(shí)時(shí)直接分析電離源（Dart，美國(guó)Ion Sense 公司）。

人 參 皂 苷 標(biāo) 準(zhǔn) 品 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rh2、CK、F2、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、notoginsenoside-R1、原人參二醇、原人參三醇、擬人參皂苷PF11、齊墩果酸Ro由吉林大學(xué)藥學(xué)院徐景達(dá)教授提供。甲醇為色譜純?cè)噭疄槌兯Ｋ募谆鶜溲趸@購(gòu)自阿拉丁（上海）試劑有限公司。

1.2 樣品制備 取人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品適量，分別加甲醇制成1 mg/mL的溶液。取TMAH適量，用色譜甲醇配成1%的溶液。

1.3 儀器條件 DART離子源參數(shù)：氦氣溫度為400 ℃，氦氣流速為2.0 L/min，干燥氣（N2）流量為9 L/min，霧化器壓力為275 kPa。

Q-TOF質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓為3 500 V，錐孔電壓為65 V，碎裂電壓為150 V，采用正離子模式和負(fù)離子模式對(duì)人參皂苷樣品進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷直接進(jìn)樣檢測(cè) 人參皂苷種類(lèi)不同，達(dá)瑪烷型（Dammarane type）二醇型、三醇型、齊墩果烷型（Oleanane）、奧克梯隆醇型（Ocotillol），以下將分別討論。

2.1.1 二醇型人參皂苷（例如：CK化合物 MW =622） 正譜解析過(guò)程如下：分子離子峰被發(fā)現(xiàn)[M+H]+（m/z 623.4360），分子脫水后形成的分子離子峰被發(fā)現(xiàn)[M- H2O+H]+（m/z 605.4167）。CK的二醇型苷元的分子離子峰被發(fā)現(xiàn)（461.3912），苷元分別脫去三分子水的分子離子峰被發(fā)現(xiàn)（407.3512，425.3611，443.3713），證實(shí)CK苷元中含有三個(gè)羥基，高溫下發(fā)生了脫水反應(yīng)。[M2+H]+（1245.8677），[M3+H]+（1869.2687），[M4+H]+（2491.6835），CK的締合體被發(fā)現(xiàn)。特征峰m/z：443、623、1245。

負(fù)譜解析過(guò)程如下：CK減氫峰，二聚體，三聚體，四聚體的減氫峰被發(fā)現(xiàn)，即[M-H]-（621.4685）、[M2-H]-（1243.9389）、[M3-H]-（1867.4109）、[M4-H]-（2489.8728）。特征峰 m/z：621、1243、1867、2489。

2.1.2 原人參二醇（MW = 460） 正譜解析過(guò)程如下：[M+H]+分子離子峰被發(fā)現(xiàn)（461.3459），該峰分別脫去三分子水的分子離子峰被發(fā)現(xiàn)（443.3524、425.3436、407.3339），證實(shí)原人參二醇中含有三個(gè)羥基，高溫下發(fā)生了脫水反應(yīng)。[M2+H]+（921.8314）， [M3+H]+（1382.0899）， [M4+H]+（1843.4574），締合體被發(fā)現(xiàn)。特征峰 m/z：425/461、921、1382。

負(fù)譜解析過(guò)程如下：發(fā)現(xiàn)了聚合體減氫峰[M-H]-（459.4100）、[M2-H]-（919.8192）、[M3-H]-（1380.2334）、[M4-H]-（1841.6502）。 特 征 峰 m/z：459、919、1380、1841。

2.1.3 原人參三醇（MW = 476） 正譜解析過(guò)程如下：[M+H]+分子離子峰被發(fā)現(xiàn)（477.3884），該峰分別脫去四分子水的分子離子峰被發(fā)現(xiàn)（459.3776，441.3672，423.3558，405.3476），證實(shí)原人參三醇中含有4個(gè)羥基，高溫下發(fā)生了脫水反應(yīng)。[M2+H]+（953.7677），[M3+H]+（1430.1496），[M4+H]+（1907.5331），締合體被發(fā)現(xiàn)。特征峰m/z：459、953、1430。

負(fù)譜解析過(guò)程如下：發(fā)現(xiàn)了聚合體減氫峰[M-H]-（475.4048）、[M2-H]-（951.8123）、[M3-H]-（1428.2204）、[M4-H]-（1905.6316）。特征峰 m/z：475、951、1428、1905。

2.1.4 奧克梯隆型——擬人參皂苷PF11（MW =800） 正譜解析過(guò)程如下：[M+H]+分子離子峰被發(fā)現(xiàn)（801.4934），沒(méi)有發(fā)現(xiàn)脫水峰。PF11脫去一個(gè)鼠李糖殘基[M-146+H]+被發(fā)現(xiàn)（655.4364），繼續(xù)脫去一個(gè)葡萄糖殘基[M-146-162+H]+被發(fā)現(xiàn)（493.3846），即擬人參皂苷的苷元峰，苷元分別脫去四分子水的分子離子峰被發(fā)現(xiàn)（475.3675、457.3564、439.3475、421.3370），證實(shí)苷元中含有四個(gè)羥基，高溫下發(fā)生了脫水反應(yīng)。特征峰m/z：493、655、801。

負(fù)譜解析過(guò)程如下：減氫峰，二聚體的減氫峰被依次發(fā)現(xiàn)，即[M-H]-（799.5210）、[M2-H]-（1600.0403）。特征峰 m/z：799、1600。

2.1.5 齊墩果烷型——齊墩果酸（Ro）（MW =956），苷元（M=456） 由于齊墩果酸中含有羧基，不適合做正譜，故選擇負(fù)譜。負(fù)譜解析過(guò)程如下：[M-H]-（955）、[M-162-H]-（793）、[M-162-162-H]-（631）、[M-162-162-176-H]-（455）、即齊墩果酸的苷元峰被發(fā)現(xiàn)，證實(shí)齊墩果酸中還有兩個(gè)葡萄糖殘基和一個(gè)6-甲酰基葡萄糖殘基，而且6-甲酰基葡萄糖殘基是連在苷元上的，兩個(gè)葡萄糖是末端連接。苷元的二聚體減氫峰也被發(fā)現(xiàn)（911）。特征峰m/z：955、793、631、455。

2.2 人參皂苷衍生化后檢測(cè) 于擎等[11]研究了人參皂苷Rb1和Rf與四甲基氫氧化銨結(jié)合后在DART源中發(fā)生甲基化及電離的過(guò)程，并從凝聚相和氣相的角度對(duì)電離過(guò)程中的甲基化機(jī)理進(jìn)行了研究。我們選用的衍生化試劑為氫氧化四甲基銨，具有較強(qiáng)的堿性和甲基化能力，同時(shí)易揮發(fā)，適合用于樣品進(jìn)行DARTMS檢測(cè)來(lái)確定結(jié)構(gòu)。

2.2.1 達(dá)瑪烷型（Dammarane type）二醇組皂苷 達(dá)瑪烷型二醇組皂苷的苷元是原人參二醇，C30H52O3，M =460.3916，二醇組人參皂苷在3號(hào)碳和20號(hào)碳上連有糖鏈，12號(hào)碳上連有一個(gè)醇羥基，其中20號(hào)碳為叔碳原子，較活撥，高溫時(shí)易斷鍵3號(hào)碳為仲碳原子，沒(méi)有叔碳原子活潑，檢測(cè)時(shí)未斷鍵。

二醇型人參皂苷共有的特點(diǎn)是可能有1～2個(gè)特征峰，峰1為人參皂苷中20號(hào)碳原子斷鍵后剩余的羥基全部甲基化后加合一個(gè)N（CH3）3H+形成的準(zhǔn)分子離子峰，峰2為人參皂苷糖鏈上的羥基和苷元上的羥基全部甲基化后加合一個(gè)N（CH3）3H+形成的準(zhǔn)分子離子峰，由于20號(hào)碳原子活潑，容易斷鍵，故峰1往往是基峰。

2.2.2 達(dá)瑪烷型（Dammarane type）三醇組皂苷 達(dá)瑪烷型三醇組皂苷的苷元是原人參三醇，C30H52O4，M =476.3866，三醇組人參皂苷在6號(hào)碳和20號(hào)碳上連有糖鏈，3號(hào)位和12號(hào)位分別連有一個(gè)醇羥基，其中20號(hào)碳為叔碳原子，較活潑，高溫時(shí)易斷鍵，3號(hào)碳為仲碳原子，沒(méi)有叔碳原子活潑，檢測(cè)時(shí)未斷鍵。三醇型人參皂苷共有的特點(diǎn)是可能有1～2個(gè)特征峰，峰1為人參皂苷中20號(hào)碳原子斷鍵后剩余的羥基全部甲基化后和加合一個(gè)N（CH3）3H+形成的準(zhǔn)分子離子產(chǎn)生的峰，峰2為人參皂苷糖鏈上的羥基和苷元上的羥基全部甲基化后加合一個(gè)N（CH3）3H+形成的準(zhǔn)分子離子產(chǎn)生的峰，由于20號(hào)碳原子活潑，容易斷鍵，故峰1往往是基峰。

2.2.3 苷元 1）原人參二醇（MW = 460）。基峰：m/z = M+14×n（羥基數(shù)目）+ N（CH3）3H+= 460+14×3+60 = 562。在譜圖中發(fā)現(xiàn)562-14，562-14×2，562-14×3的峰，證明原人參二醇苷元中含有三個(gè)醇羥基，由于20號(hào)位的羥基空間位阻較大，不易甲基化，故562-14的峰豐度較高。特征峰m/z：562，562-14。2）原人參三醇（MW = 476）。基峰：m/z = M+14×n（羥基數(shù)目）+ N（CH3）3H+= 476+14×4+60 = 592。在譜圖中發(fā)現(xiàn)592-14，592-14×2，592-14×3，592-14×4的峰，證明原人參三醇苷元中含有四個(gè)醇羥基，由于20號(hào)位的羥基空間位阻較大，不易甲基化，故592-14的峰豐度較高。特征峰m/z：578，592。

2.2.4 奧克梯隆醇型——擬人參皂苷PF11（M =800） 基峰：m/z = M+14×n（羥基數(shù)目）+ N（CH3）3H+= 800+14×9+60 = 986。在譜圖中發(fā)現(xiàn)986-14，986-14×2，986-14×3的峰，證明原人參三醇苷元中含有三個(gè)醇羥基，由于20號(hào)位的羥基空間位阻較大，不易甲基化，故986-14的峰豐度較高。986+14：m/z = M-M（glc）+14×n（羥基數(shù)目）+ N（CH3）特征峰m/z：986。

2.2.5 齊墩果烷型——齊墩果酸（Ro）（MW =956），苷元（M = 456） 峰1：甲酰氧基斷裂，m/z =（M-glc）+14×n（ 羥 基 數(shù) 目）+ N（CH3）3H+=956-180+14×7+60 = 934。 峰 2： 苷 鍵 斷 裂，m/z =（M-162）+14×n（羥基數(shù)目）+ N（CH3）3H+= 800-162+14×8+60 = 966。見(jiàn)圖 1。

圖1 Ro衍生化DART-MS圖

在譜圖中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Ro全部甲基化后和N（CH3）3H+結(jié)合的分子離子峰，說(shuō)明28號(hào)碳原子以酯鍵形式存在，在實(shí)驗(yàn)條件下極易斷裂，故基峰為28號(hào)碳原子的酯鍵斷裂后形成的峰，即峰2。譜圖中還發(fā)現(xiàn)了934+14，966+14，是與N（CH3）4+結(jié)合的結(jié)果。值得注意的是，其他類(lèi)型的皂苷的特征峰斷鍵時(shí)只有一種情況，而Ro斷鍵時(shí)兩種情況均體現(xiàn)出來(lái)，其中甲酰氧基斷裂的情況豐度較高，為基峰。特征峰m/z：934，966。

2.3 人參皂苷化合物及其特征峰 見(jiàn)表1。

表1 人參皂苷化合物及其特征峰

3 討論

本文應(yīng)用了DART-MS技術(shù)對(duì)人參皂苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性檢測(cè)，該技術(shù)具有通用性強(qiáng)、耐用性好、檢測(cè)靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可以對(duì)不同的人參皂苷及人參皂苷同分異構(gòu)體之間進(jìn)行區(qū)分，還可以檢測(cè)含有人參皂苷的樣品，對(duì)該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究有一定的重要意義。

首先可以進(jìn)行不同的人參皂苷的區(qū)分。人參皂苷-Rf是人參的特征成分，而24（R）-假人參皂苷PF11是西洋參的特征成分，三七所獨(dú)有的皂苷類(lèi)成分，如三七皂苷（notoginsenoside） R1。它們?cè)贒ART-MS中體現(xiàn)的特征峰不同，故可將三種不同物質(zhì)區(qū)分開(kāi)。

其次可以進(jìn)行人參皂苷同分異構(gòu)體之間的區(qū)分。不同結(jié)構(gòu)的人參皂苷體現(xiàn)的特征峰不同，有一些互為同分異構(gòu)體的人參皂苷體現(xiàn)的特征峰也不相同，可以利用DART-MS技術(shù)將它們區(qū)分開(kāi)。F2與Rg2的分子量均為784.497 3，但是它們的衍生化產(chǎn)物的特征峰不同，F(xiàn)2的特征峰是734、970，而Rg2的特征峰只有970，沒(méi)有734，可以將二者區(qū)分開(kāi)；Rg1與Rf的分子量均為800.4922，但是它們的衍生化產(chǎn)物的特征峰不同，Rg1的特征峰是764、1 000，而Rf的特征峰只有1 000，沒(méi)有764，可以將二者區(qū)分開(kāi)。

最后可以檢測(cè)含有人參皂苷的樣品。樣品有莖葉總皂苷、人參根總皂苷、三七總皂苷、紅參總皂苷，在得到的譜圖中均含有938特征峰，表明其中可能還有Rb1、Rd、Rb2、Rc、Re、Rb3，而這些正是人參中的常量皂苷，豐度最高，為基峰，在上述四種物質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)了1174的峰，這正是Re的特征峰，表明它們均含有Re。在三七總皂苷中還發(fā)現(xiàn)了764、924，這是Rg1和R1的特征峰。